Ein Anion Austausch Harz-basierte Methode, angepasst an Flüssigkeit, die Impingement-basierte Bioaerosol Probenahme von Viren nachgewiesen wird. Kombination mit nachgeschalteter molekulare Erkennung ermöglicht die Methode facile und empfindlichen Nachweis von Viren von bioaerosolen.
Dieses Protokoll zeigt eine angepasste Bioaerosol Sampling-Methode für Viren. In diesem System ist Anion Austausch Harz mit flüssigen Impingement-basierten Air Probenahmegeräte für wirksame Konzentration von negativ geladenen Viren von bioaerosolen gekoppelt. So dient das Harz als zusätzliche Konzentration Schritt im Workflow Bioaerosol Probenahme. Nukleinsäure-Extraktion der viralen Partikel erfolgt dann direkt aus dem Anion Austausch Harz, mit der sich daraus ergebenden Probe für Molekulare Analysen geeignet. Dieses Protokoll beschreibt weiter, eine Custom-Built Bioaerosol Kammer erzeugen Virus beladenen Bioaerosole unter verschiedensten Umweltbedingungen und damit für die kontinuierliche Überwachung der Umgebungsvariablen wie Temperatur, Feuchtigkeit, Windgeschwindigkeit und Aerosol Massenkonzentration. Der wesentliche Vorteil der Verwendung dieses Protokolls ist erhöhte Empfindlichkeit des Viren-Erkennung, da mittels direkter Vergleich zu einer unveränderten konventionelle flüssige Ausbeute bewertet. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, diverse negativ geladene Viren, die niedrigen Kosten der Anion Austausch Harz (~$0.14 pro Probe) und Benutzerfreundlichkeit zu konzentrieren. Nachteile sind die Unfähigkeit dieses Protokolls, Infektiosität von Harz adsorbiert Viruspartikel zu bewerten, und möglicherweise die Notwendigkeit zur Optimierung des Puffers flüssige Probenahme verwendet innerhalb der Ausbeute.
Der Zweck dieser Methode ist eine hochsensible Bioaerosol Probenahme Plattform zur molekularen Erkennung von negativ geladenen Viren von bioaerosolen Erleichterung bieten. Mikroorganismen, einschließlich Viruspartikel, können über einen längeren Zeitraum der Zeit1in bioaerosolen überleben. Bioaerosole können über relativ große Entfernungen reisen und Lebensfähigkeit und Infektiosität, zu erhalten, wie ein Ausbruch der Legionärskrankheit belegt, die aus industriellen Kühltürme befindet sich in einer Entfernung von 6 km von den betroffenen Personen stammen und 18 Todesfälle2führte. Indirekter Übertragung von Viren auf den Menschen vermittelt durch Bioaerosole für Norovirus Ausbrüche in Schulen und Restaurants3,4nachgewiesen und kann in mehreren Einstellungen auftreten. In ähnlicher Weise kann Bioaerosol Übertragung von Viren in landwirtschaftlichen Einstellungen wie z. B. bei Schweinen und Geflügel betrieben, mit dieser Übertragungsweg als ein wichtiger Faktor in der Bewegung von Viren zwischen Produktion Einrichtungen5, auftreten. 6 , 7 , 8 , 9.
Effektive Probenahme von bioaerosolen Virus beladenen ermöglicht eine Verbesserung der Schnelldiagnostik und Bereitschaft zur ausbruchsprävention, wie bei Demonstrationen gezeigt welche H5, Grippe eine Viren wurden von bioaerosolen im lebenden Tier entdeckt in China Märkten und die USA10,11. Aktuellen Bioaerosol-Sampling-Technologien beinhalten eine Reihe von verschiedenen Teilchen erfassen Prinzipien und in Impingers, Zyklone, Impaktoren und Filter12breit kategorisiert werden können. Es sprengt den Umfang dieses Protokolls erschöpfend decken alle Vorteile und Nachteile dieser Plattformen für die Probenahme von bioaerosolen Viren; Allerdings ist festzuhalten, dass der Großteil dieser Probenahmegeräte für die Sammlung von Viren und Bakteriophagen13nicht optimiert wurden. Darüber hinaus ist Infektiosität der Viruspartikel oft negativ beeinflusst, mit flüssigen Impingers als virale Infektiosität effektiver als sampling-Geräte wie solide Impaktoren oder Filter14pflegen. Ein Nachteil des flüssigen Impingement ist jedoch der Verwässerungseffekt Ziel, die tritt auf, weil Viren in relativ großen Mengen (in der Regel ≥20 mL) Flüssigkeit in den Sammelbehälter aufgefangen werden. Ein weiterer wichtiger Nachteil beinhaltet die suboptimale Effizienz des flüssigen Impingers Partikel konzentrieren < 0,5 µM in Größe15. Capture Effizienz dieser Geräte kann jedoch durch Immobilisierung auf festen Matrizen verbessert werden, wie Immobilisierung Erhaltung der viralen Nukleinsäuren und virale Infektiosität16,17verbessern kann.
Wir haben bereits gezeigt, dass Anion Austausch Harz ein wirksames Instrument für die Erfassung und die Konzentration der Viren aus flüssigen Matrizen ist, einschließlich F-RNA Bakteriophagen, Hepatitis A-Virus, menschliche Adenovirus und Rotaviren18,19 ,20. Wie vom Hersteller definiert, ist das Anion Austausch Harz genutzt in diesem Werk ein Macroreticular Polystyrol starke base Anion Austausch Harz in der funktionalisierten quartäres Amin Gruppen vermitteln Attraktion und Erfassung von Anionen in einer flüssigen Mittel21 . Infolgedessen soll das Anion Austausch Harz Viren mit Net-Negative Oberfläche Gebühren, einschließlich viele enterischen Viren, Influenza-Viren und andere Viren relevant für die Gesundheit von Mensch und Tier zu erfassen.
Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Zugabe von Anion Austausch Harz zu einem flüssigen Ausbeute. In diesem System dient das Harz als eine sekundäre Konzentration Schritt für virale Partikel in die Ausbeute Flüssigkeit gefangen genommen. Nukleinsäuren können dann direkt in kleinen Mengen, bietet eine konzentrierte Probe für Molekulare Analysen eluiert werden. Der Hauptvorteil dieser Methode deshalb die Verbesserung der viralen Nachweisempfindlichkeit, vor allem durch Verringerung des Volumens der Probe. Darüber hinaus aufgrund der inhärenten unspezifische Einnahme negativ geladene Viren, die Methode ist wahrscheinlich für die Erkennung einer Vielzahl von Viren von Interesse. Hier wird die Methode für Impfstämme Typ A und Typ B Influenza-Viren und die FRNA Coliphage MS2 (MS2) demonstriert. Diese Viren sind anschließend mit standard qRT-PCR-Assays als zuvor beschriebenen22nachgewiesen. Der Endpunkt-Benutzer sollten nicht erwarten, Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Methode, da Änderungen an der aktuell vorhandenen Geräte sind keine größere Störungen zu den herkömmlichen Fluss Bioaerosol Probenahme-und Analysemethoden.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sensible virale Erfassung von bioaerosolen mit modifizierten flüssigen Impingers. Die Methode ist für die Erkennung und Quantifizierung von der Viruslast in bioaerosolen optimiert. Die gezielte Modifizierung demonstriert hier beinhaltet die Zugabe von Flüssigkeit in eine gemeinsame flüssige Impinger enthaltenen Anion Austausch Harz. Diese Methode wurde für seine Einfachheit in nachgeschalteten Probenverarbeitung entwickelt, wobei andere Probe Verarbeitungstechniken wie Z…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von CDC/NIOSH High Plains Intermountain Center für landwirtschaftliche Gesundheit und Sicherheit (5U54OH008085) und Colorado Bioscience Entdeckung Auswertung Subventionsprogramms (14BGF-16).
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
1 mL pipet tips | NA | NA | |
1 mL pipettor | NA | NA | |
50 mL serological pipet | NA | NA | |
PCR tubes | NA | NA | |
Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
HEPA capsule | PALL | 12144 | |
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
Bioaerosol chamber | NA | NA |