발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.
세균성 종의 상당수는 빛을 방출 수 있습니다. 그들의 모든 공유 같은 유전자 클러스터, 즉 럭 스 오 페론. 이 유사성에도 불구 하 고 이러한 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광의 규정 특성에 극단적인 변화를 보여줍니다. 여기에 제시 된 방법은 플레이트 리더를 활용 하 여 시간이 지남에 따라 녹음의 세포 성장 및 발광의 발광 강도 결합 하 여 새로 개발된 된 분석 결과입니다. 결과 성장 및 발광 특성 쿼럼 감지 규칙 등 각 세균성 긴장의 중요 한 기능에 연결할 수 있습니다. 다양 한 발광 박테리아의 특정 매체 (예: 인공 바다 물 매체)를 요구 하 고 온도 정의. 쉽게 처리, 비 발광 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균), 다른 한편으로, 수 수 재배 저렴 하 게 실험실 규모에서 높은 수량. 럭 스 전체 포함 하는 플라스 미드를 도입 하 여 대장균 을 이용 오 페론 실험 조건 단순화할 수 하 고 또한 미래의 응용 프로그램에 대 한 많은 가능성을 엽니다. 모든 럭 스 유전자는 대장균 식 스트레인을 활용 하 여 표현의 깁슨 복제를 통해 한 식 플라스 미드의 건설과 7 럭 스 유전자와의 3 개의 갈비뼈 유전자를 포함 하는 4 개의 파편의 삽입에 의해 달성 되었다 pET28a 벡터에 럭 스 리브 오 페론. 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 유도 하 고 발광 대장균 인 이소프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 추가 통해 제어 수 셀. 이 시스템의 장점은 쿼럼 규제 제한 및 비표준 성장 조건에 따라 복잡 한 중간 작곡과 같은 감지를 피하기 위해 온도 정의 합니다. 이 시스템은 럭 스 오 페론에서 각 유전자의 새로운 유전자, 다른 한 세균성 긴장에서 luxAB 유전자 교환도 추가 또는 여 럭 스 유전자와 그들의 상호 작용의 분석을 수 있습니다 또는 단백질 복합물, luxCDE등을 분석.
살아있는 유기 체 (생물 발광)에 의해 빛의 방출은 박테리아, 곰 팡이, 곤충, 선 충, 생선, 그리고 오징어1에 매혹적인 과정입니다. 발광 빛 방출 chemiluminescent 반응 있는 화학 에너지는 (부분적으로) 변모 빛 에너지 (“차가운 빛”)에서 나온다. 발광 박테리아 heterodimeric 효소 luciferase catalyzes 긴 사슬의 지방 족 알데하이드, 490 nm2, 에서 최대 발광 함께 해당 산 tetradecanal 등 monooxygenation 3.
그림 1 : 세균 luciferase의 일반적인 반응 계획. (LuxAB) 세균성 luciferase catalyzes 긴 체인의 monooxygenation 알데하이드 (채널3(채널2)n조) 이용 하 여 플 라빈 mononucleotide (FMNH2)과 분자 산소 (O2), 저조한 제품 감소 오래 산 (채널3(채널2)nCOOH), 플 라빈 mononucleotide (FMN), 물 (H2O), 그리고 가운데 490에 빛의 방출 체인 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 산화 동안 풀어 놓인 에너지는 상태 발광 소4역할 FMN-4a-수산화 발생 합니다. 세균 생물 발광, 즉 LuxCDABEG, 에 관련 된 단백질은 럭 스 오 페론에 의해 인코딩되고 매우 다양 한 세균성 긴장2,5이상의 보존. 유전자 거 와 luxB 는 heterodimeric luciferase;에 대 한 인코딩 luxC의 luxD의및 luxE의 유전자 제품은 복잡 한; 지방산 reductase의 구성 요소 그리고 luxG 플 라빈 reductase6인코딩합니다. 다양 한 발광 Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) 추가 luxF 유전자를가지고. LuxF는 특이 한 플 라빈 파생 6-(3′-(R)-myristyl homodimeric 단백질은 보고 되었다)-FMN (myrFMN)7,,89,10,11 ,12. 추가적인 유전자 확인 된 리 보 플 라빈 합성 (예: ribEBH)에 대 한 책임은 또한 규제 유전자 보고 되었습니다, 그 생물 발광, 특히 비 브리 오에 대 한 쿼럼 감지 규칙에 있는 역 fischeri 브리 harveyi6,13. 높은 보존된 유전자 순서에도 불구 하 고 발광 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광2,5,14의 규정 특성에 높은 변화를 표시 .
몇 가지 수정 긴장 또는 부분을 포함 하는 플라스 미드 또는 전체 럭 스 operons 알려져 있습니다 기자 시스템 생물 발광을 이용. 발기인 활동을 결정 하는 등 다양 한 응용 프로그램 환경 또는 식품 샘플, 생물 발광 공명 에너지 전송 (브 레트), 세균 오염 모니터링 vivo에서 화상 진 찰 진 핵 유기 체에서 감염의 pyrosequencing, 고 등 설립된15,,1617를 했다. 흥미롭게도, 3 가장 자주 사용 되는 시스템은 북미 반딧불 (Photinus pyralis), 선 충 (Photorhabdus luminescens)의 장 병원 체 그리고 바다 팬 지 (Renilla에서 파생 된 발광 기자 reniformis). 그 시스템의 세균성 근원 하지만 럭 스 유전자와 operons 세균성 근원에서를 사용 하 여 응용된 연구16에 대 한 더 많은 관심을 얻고 있다. 세균성 근원에서 생물 발광 단백질의 덜 풍부한 응용 프로그램은 주로 낮은 안정성 그리고 박테리아의 발광 단백질 그들의 해양 서식 지에 관련이 있을 수 있습니다 파생 된. 해양 서식 지의 발광 박테리아는 표준 실험실 조건 하에서 cultivable있지 않습니다. 이 박테리아는 특정 성장 매체와 같은 인공 바다 물 중간 및 낮은 성장/부 화 온도 (예를 들어, 28 ° C) 조건 필요합니다.
럭 스 오 페론 특성 또는 단일 럭 스 의 비교를 단순화 하기 위해 유전자의 다른 발광 세균성 긴장, 럭 스 오 페론 식 및 분석 표준화 하는 방법의 범위는 필수입니다. 따라서, 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균)으로 전체 럭 스 리브 오 페론을 통합의 아이디어는 나왔다. 이 위해 깁슨 어셈블리 특정 제한 사이트에 대 한 필요 없이 하나의 벡터에 다중 선형, 겹치는 파편을 통합 하는 유용한 도구가 될 입증. 이 방법은 또한 적당 한 DNA 삽입은 너무 큰 때 ( luxCDABFEG-ribEBHe.g.,P mandapamensis 27561; ~ 9 kb 오 페론 크기) PCR을 통해 증폭 될. 럭 스 오 페론 여러 겹치는 조각으로 분리 될 수 있습니다 한 식 플라스 미드로 조립 그리고 마지막으로 시퀀스 확인 어셈블리 제품 직접 적절 한 대장균 으로 변형 될 수 있다 높은 수율에 대 한 시스템 단백질 식18,,1920. 뿐만 아니라 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 취급 하 게 쉬운, 세포 성장 및 발광 빛 방출의 녹음을 결합 하는 간단한 방법을 설립 남아 있었다. 여기 설명 하는 방법을 현장에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 빛 방출 수 있습니다.
럭 스 유전자와 럭 스 오 페론 순서와 한편으로, 인공 발광 대장균 , 다양 한 발광 박테리아의 규정의 분석 시스템 P.의 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하 mandapamensis 27561 고 다른 손, 결합 세포 밀도와 발광, 녹음 현장에서 새로 개발된 된 플레이트 리더 분석 결과 다양 한 세균성 럭 스 시스템에 대 한 더 많은 정보를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 이 기본적인 특성 및 luciferases 및 관련된 효소의 비교 향상 된 안정성 및 활동 대안 이미 설립된 기자 시스템을 발생할 수 있습니다.
P. mandapamensis 27561의 전체 럭 스 리브 오 페론 구성 하는 4 개의 파편을 포함 하는 식 플라스 미드의 건설 깁슨 복제를 통해 달성 되었다. 이 대장균 기반 럭 스 유전자 발현에 빛을 방출 하는 대장균 세포 수 있습니다. 쿼럼 규정과 표준이 성장 조건 감지 피하이 시스템의 상당한 장점이 있습니다.
깁슨 복제 전략을 사용 하 여의 장점은 여러 선형 DNA 파편, 높은 유연성 및 특정 제한 사이트18,19,20에 대 한 필요의 쉬운 조립입니다. 이 메서드는 쉽게는 럭 스 오 페론, 단일 유전자 또는 유전자 클러스터를 제외 하 고 또는 새로운 유전자를 소개 또는 또 다른 한 긴장에서 유전자 교환를 변경할 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램에 대 한 전제 조건 각각 럭 스 오 페론 유전자 시퀀스의 가용성 이다. 발광 박테리아의 작은 수에 대해서만 각각 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서 알려진 사용할 수 있습니다. 이 시퀀스의 많은 샷건 시퀀싱을 사용 하 여 생성 된 때문에 조각화 됩니다. 27561 조사 P. mandapamensis 의 경우 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서는 알려진 NCBI 유전자 데이터베이스 (은행: DQ988878.2).
깁슨 어셈블리의 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 단일 조각의 DNA 농도의 계산 이다. 0.2-사용을 권장 했다 제조업체의 어셈블리 프로토콜에서 0.5 pmols 및 4-6 조각20,2120 µ L의 총 볼륨. 우리의 경우, 어디 luxCDABFEG ribEBH 는 4 조각으로 이루어져, 농도 및 총 볼륨 되었고 0.1 pmol 45 µ L, 각각, PCR 제품의 수익률에 따라. 한편으로, 농도 감소 하 고 다른 한편으로, 볼륨 증가 했다. 그럼에도 불구 하 고, 어셈블리 유효 하 게 매우 작용 하 고 DNA 시퀀싱 확인 첫 번째 시도에서 올바른 삽입. 이 찾기 쉽게 수정된18,,1920수 우리의 조사에 대 한 강력 하 고 적절 한 방법으로 깁슨 어셈블리 확인.
새로 설립된 된 플레이트 리더 분석 결과 메서드를 취급 하 게 쉬운 이다. 그것은 새로운의 간단한 기본 분석 가능 (유엔-) 알려진 또는 발광 세균 긴장과 제공 이미 빛 생산 (예를 들어, 낮은 세포 밀도에 발광에 지연)의 규제 메커니즘에 첫 번째 힌트. 또한, 함께 빛 생산 성장 조건 단순히 성장 매체 또는 온도 변경 하 여 쉽게 평가할 수 있습니다.
플레이트 리더 측정 28 ° c.에 수행 되었다 이 특이 한 설정에 대 한 이유는 30 ° C 이상의 온도 또는 심지어 전혀 성장 및 발광 리드 발광 세균성 긴장의 온도 감도 이다. Note, 플레이트 리더는 활성 냉각 시스템 누락의 제한 시간 동안 정의 된 온도 유지 수 있습니다. 따라서, 온도 측정 온도 수 있다.
개념의 증거로 서 발광 긴장 대장균 구문의 비교 P. mandapamensis (그림 5) 한 손으로 및 참조 측정 (그림 4)에 다른 한편으로 수행 및 확인 이 새로 설립된 된 시스템의 신뢰성입니다. 또한, 장기 측정 빛 방출 (그림 6)의 장 수를 보장합니다. 하지만 한 OD 값이 어디 적절 한 희석에 측정을 위해 필요한 것 사용 되는 측정 장치 (현재의 경우에서 약 15 h)의 특성에 따라 특정 광학 밀도, 위의 신뢰할 수 있는 고려 하는 검출기의 선형 범위입니다. OD 값에서이 높은 분산 확인이 오랜 시간 측정 신뢰할 수 없습니다. 따라서, 10 h 같은 짧은 측정은 여기 보고 실험 설정을 사용 하 여 것이 좋습니다.
설립된 플레이트 리더 분석 결과의 한계는 그림 7에서 볼 수 있습니다. 어려움은 측정의 적절 한 설정을 찾는 것입니다. ” 값 이득 사진 승수 관 (PMT)의 감도 조정합니다. 이득은 높은 이득 률은 신호 증가 의미 PMT에 신호 증폭 이다. 이득이 너무 낮게 설정 되어, 신호 대 잡음 비 증가 및 “낮은” 빛나는 발광 박테리아의 빛 강도 수 없습니다 하는 경우 어떤 더 많은 (표시 되지 않음 데이터 0에 가까운 신호)를 측정. 발광 분석 결과에 도전은 모든 세균성 긴장에 대 한 측정 결과 악기의 범위 내에서 머물 그래서 이득을 설정 하는 것 이다. 또한, 발광의 측정 범위는 측정 간격 시간에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 2000000 1의 최대 s).
이득 2800, 경험적으로 테스트 하 고 특정 플레이트 리더가이 방법의 설립에 사용에 대 한 선택 이었다는 설정 했다. 사용된 이득 설정 허용 최대 방출된 빛의 녹화는 발광 하 여 대장균 시스템, P. mandapamensis 27561, P. mandapamensis s 1는 오버플로 없이 하지만 긴장 P. mandapamensis TH1 및 에 대 한 Harveyi V. 14126 이득 너무 높았다. 따라서, 이러한 후자의 변종 검출 한계를 초과 하 고 진짜 최대한 빛의 강도 측정할 수 없습니다. 이 기술적 제한 성장 조건 및 셀 밀도 비교할 수도 있지만 최대 발광에 높은 변화를 표시 하는 발광 박테리아의 비교를 방지 수 있습니다.
사용된 잘 플레이트 내에서 분석 된 세균성 긴장의 위치 경험적으로 평가 될 수 있다. 유리 바닥으로 검은 잘 접시 사용 되었다, 비록 샘플 사이 누화 관찰 되었다. 특정 긴장의 빛의 강도 너무 높은, 모든 이웃 웰 스 (예: 공백) 잘못 된 긍정적인 빛 배출량 표시 됩니다. 따라서, 그것은 개별적으로 또는 서로 특정 공간 분리와 함께 두 개의 다른 긴장을 측정 하는 것이 중요입니다.
많은 대장균 변종 럭 스 오 페론의 부분을 포함 하는 알려진 수정 되며 주로 응용 프로그램 지향15,,1617이미 있다. 여기에 설명 된 방법을 기초 연구, 예를 들어 각 럭 스 유전자를 별도로 분석의 가능성을 목표로 합니다. 생물 발광의 연구는 오랜 역사를가지고, 있지만 여전히 많은 관련 질문 있습니다. 제외 또는 럭 스 오 페론에서 유전자를 도입, 교환 다른 긴장에서 유전자 luxAB 유전자 또는 단백질을 분석 하 여 단지, 대장균 시스템 및 판의 추가 응용 프로그램을 처리 하기 쉬운에 포함 독자 분석 결과, 규제 프로세스 및 럭 스 유전자의 기능에 더 많은 정보를 얻을 수 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
플레이트 리더에 대 한 자체 서 면된 스크립트에서 그의 지원을 위한 Wladislaw 마이어 (BMG Labtech GmbH) 감사 하겠습니다. 이 작품은 오스트리아에 의해 지원 되었다 “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) 오후 (P24189) 및 박사 학위 프로그램 “DK 분자 Enzymology” (W901) 오후.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
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