Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.
Eine nützliche Technik für die Kultivierung von Zellen in einem selbstorganisierenden Nanofaser dreidimensionale (3D) Gerüst wird beschrieben. Diese Kultursystem erschafft eine Umgebung, die genau die Strukturmerkmale der unpolarisierte Gewebe imitiert. Darüber hinaus macht die besondere innere Nanofaser-Struktur des Gerüstes es transparent für sichtbares Licht, ermöglicht eine einfache Visualisierung der Probe unter Mikroskopie. Dieser Vorteil wurde weitgehend zur Zellwanderung, Organisation, Verbreitung, und Differenzierung und somit jede Entwicklung ihrer bestimmten zellulären Funktion durch Färbung mit bestimmten Farbstoffen oder Sonden zu studieren. Darüber hinaus in dieser Arbeit beschreiben wir die gute Leistung dieses Systems leicht die Redifferentiation der erweiterten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten in knorpelige Gewebe zu studieren. Zellen wurden in selbst zusammenbauen Peptid Gerüste gekapselt und kultiviert unter bestimmten Bedingungen werden zu fördern. Dreidimensionale Kulturen zeigte gute Rentabilität während der 4 Wochen des Experiments. Wie erwartet, Proben mit Chondrogenic induzieren (im Vergleich zu nicht induzierten Kontrollen) kultivierten befleckt stark positiv für Toluidin-blau (die Glykosaminoglykane (GAGs), die hoch in extrazellulären Knorpelmatrix sind Flecken) und zum Ausdruck gebracht spezifische molekulare Marker, einschließlich Kollagen Typ I, II und X, nach Western-Blot Analyse. Dieses Protokoll ist leicht zu führen und an Research Laboratories, Branchen und für pädagogische Zwecke in Laborübungen einsetzbar.
Seit vielen Jahrzehnten wurde Säugetier-Zellkultur unter experimentellen Bedingungen mit klassischen zweidimensionalen (2D) Kultur-Systemen aus praktischen und ökonomischen Gründen unabhängig von der nicht-physiologische Aspekte durchgeführt. Obwohl dieses Kultursystem hilft, zu studieren und die molekulare und zelluläre Mechanismen zu verstehen, wissen wir heute, dass neue Zelle Kultur Paradigmen benötigt werden, um komplexere zelluläre Systeme zu studieren. Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme sind daher notwendig, um eine Mikroumgebung neu zu erstellen, die biophysikalisch, biomechanisch und biologisch mehr ähnlich dem des natürlichen Geweben. In den letzten Jahren 3D Culture Systeme im Allgemeinen geworden häufiger bei Forschern und der Industrie da sie ein neues Modell der Studie darstellen oder screening in welche Zellen können im Raum wachsen, Erstellen von Zelle zu Zelle oder Zellen-Matrix Interaktionen, Migration und schließlich in bestimmte Zelle Linien unterscheiden.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, eine in-vitro- zelluläre Mikroumgebung zu erschaffen, die näher an der Mikroumgebung in Vivo . Insbesondere ist die synthetischen selbstorganisierende Peptid-Gerüst (SAPS) eine Art von Biomaterial mit einzigartigen Eigenschaften; Es bildet ein Netzwerk aus nanometergroßen Poren machte aus schwachen Wechselwirkungen zwischen Peptiden mit mechanischen und strukturellen Eigenschaften ähnlich denen der natürlichen extrazellulären Matrizen. Das heißt, die Rationalität hinter der Nutzung dieses Materials ist, dass es eine wirklich 3D Umgebung schafft, die eignet sich für den Erhalt der Pseudo-3D-Gewebe oder Organ-Einheiten. Aber am wichtigsten ist, 3D Rahmen ermöglicht die 3D-Struktur zu neuen biologischen Funktionen, die normalerweise nicht in 2D Kultur Plattformen vorhanden sind, wie z. B. Eigenschaften in Bezug auf Gewebearchitektur, Stoffaustausch Phänomene, Zell-Musterung und schließlich Gewebe Morphogenese, die Schlüsselfaktoren in zukünftige Forschung und Entwicklung von funktionellen Geweben und Organen1,2sind. Darüber hinaus ist ein Vorteil des SAPS über ihre natürlichen Pendants (Kollagen, Matrigel), dass sie sehr stabil bei Raumtemperatur und erfordern keine besondere Bedingungen für die Post-Produktion, Verbreitung oder Speicherung3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS ist leicht zu handhaben, wenn gewünscht; 3D Gele erhalten Sie einfach durch die Erhöhung der Ionenstärke oder durch Einstellen des pH-Werts um Neutralität1,2. Schließlich, die hier beschriebene Methode extensiv genutzte in Vitro wurde zur Wartung, Wachstum und Differenzierung verschiedener Zelltypen, einschließlich der Hepatozyten, Endothelzellen, Osteoblasten, Chondrozyten, neuronalen Zellen sowie Förderung als embryonale und somatische Stammzellen3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. in der vorliegenden Arbeit beschreiben wir die Verwendung von 3D Kultursystem, menschliche erweiterte artikuläre Chondrozyten (hACh) in Knorpel-ähnliches Gewebe als zuvor beschriebenen11zu unterscheiden.
Hier ist eine Methode, um Kultur-Zellen in einem 3D-System mit SAPS beschrieben. In diese synthetische Biomaterialien sind Zellen zunächst mit einer peptidlösung anschließend induziert wird, selbst-zusammenbauen, gemischt, Schaffung eines Netzes von nanometrischen Dimensionen um die Zellen und damit eine wirklich 3D Umgebung (Abbildung 1). Es ist wichtig zu bedenken, dass zelluläre Verhalten von Matrix Steifigkeitswerte (z. B. Proliferation, Migration und Differenzierung) betroffen ist. Daher ist ein gemeinsame methodischer Kontrolle auf Zellkulturen auf das Peptid-Gerüst mit die gleichen Steifigkeitswerte (Kultur auf zwei Dimensionen).
Zuvor haben unsere Gruppe und andere die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Kultur-Plattformen mit verschiedenen Zelle Systeme3,4,5,6,7,8 beschrieben ,9,10,11,12,13,14,15. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Gewinnung von 3D Culture Systeme, die für jede Art von Säugerzellen einschließlich jede Art von funktionalen Zelle, embryonalen und adulten Stammzellen, oder schließlich, dysfunktionale Zellen isoliert von Biopsien oder Tumoren, und So weiter. Darüber hinaus unabhängig, hätten wenn Stammzellen embryonaler oder Erwachsenen Ursprungs sind eine bessere Linie Engagement Kapazität in der 3D-Umgebung als in klassischen 2D Kultur Gerichte10,11,12, 13,14,15. Deshalb würde die Zellkultur in diesem System zu einer Differenzierung in funktionale Gewebe-ähnliche Strukturen führen, die in verschiedenen Anwendungen von reparative oder regenerative Biomedizin zu toxikologischen und pharmakologischen Plattformen verwendet werden könnte.
Wir haben einen klaren Gewinn in der Zelle Funktion gezeigt, da die zellulären Mikroumgebung ähnlich dem des natürlichen Gewebe in Bezug auf die Matrix-Struktur und biomechanischen, biophysikalischer und biologischer Parameter ist. Dennoch, wie das System komplexer wird, reguliert die Anzahl der Parameter, die sein müssen auch erhöht, beinhaltet die Notwendigkeit einer externen unterstützende Plattform (z. B. eine aktive Perfusion System, Stoffaustausch Phänomene verbundenen Probleme zu vermeiden ). Dreidimensional kultivierte Zellen leistungsfähiger in Bezug auf die Regulierung der wesentlicher Aktivitäten, wie z. B. Migration, Proliferation und Differenzierung. Sie können komplexe Netzwerke ermöglicht verbesserte zelluläre Übersprechen, das ist bei weitem eine wesentliche Folge des Anbaus und der Differenzierung in 3D bilden. Die Tatsache, die SAPS konnte Bedingungen in-vitro- ähnlich wie die extrazelluläre Matrix Proteine stellt erstellt seit einer rationalen Studie über die Wirkung von Vorteil für die einzelnen Komponenten hinzugefügt, um das Gerüst (Wachstumsfaktor, Polysaccharid oder Signalisierung hergestellt Peptid) konnte problemlos durchgeführt werden.
Die eindeutigen Vorteile des Einsatzes von SAPS im Vergleich zu anderen natürlichen Gerüste wie Kollagen Typ I und Matrigel, sind die folgenden: 1) SAPS ist eine synthetische Biomaterialien mit minimaler Abweichung von Batch zu Batch-Produktion; (2) SAPS hat die Fähigkeit, mit spezifischen Peptid Motiven funktionalisiert werden; und 3) SAPS stellt geringe biologische Abbaubarkeit in Vitro, die die Wartung der 3D Konstruktion mit den gleichen biophysikalischen, biomechanischen und strukturellen Eigenschaften im Laufe der Zeit erlaubt. Jedoch die Einschränkung bei der Verwendung im Vergleich zu anderen SAPS Gerüste findet während der Kapselung Schritt wo sind Zellen in einem feindlichen Milieu aufgrund des niedrigen pH-Wertes. Daher ist dies ein entscheidender Schritt in der beschriebenen Methodik. Darüber hinaus ist es wichtig, die SAPS-Konzentration für jeden bestimmten Zelltyp vor Beginn jedes Experiment zu setzen. Dies ist in der Tat unerlässlich, wenn Zellen auf oder in diese Biomaterialien kultiviert werden, da jedes bestimmten Zelltyp optimale biomechanische Wachstumsbedingungen präsentieren wird.
Schließlich glauben wir, dass die Konstruktion und Herstellung dieser Art von Biomaterial Gerüst die Entwicklung von physiologischen und zuverlässigere 3D Gewebemodelle zu helfen, bessere therapeutische Ansätze für die Entwicklung die pharmazeutische Industrie verbessern würde Regenerative Medizin, Krebs oder einer medizinischen Behandlung.
The authors have nothing to disclose.
Die Forschungsarbeiten, die von den Autoren wurde zum Teil durch Zuschüsse der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 229239 und der AO Foundation, Explorative Forschung Collaborative Research Programm akute unterstützt Knorpel Verletzung/Läsion/defekt (CRP ACI) im Rahmen des Projekts Bioactive und Biomimetic Scaffolds für Knorpel Regeneration (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |