여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.
자가 조립 nanofiber 3 차원 (3D) 비 계에서 세포 배양을 위한 유용한 기술 설명 되어 있습니다. 이 문화 시스템에 밀접 하 게 비 편광 조직의 구조적 기능을 모방 하는 환경을 다시 만듭니다. 또한, 발판의 특정 내장 nanofiber 구조 게 그것은 투명 한 현미경 아래 샘플 쉽게 시각화할 수 있는 비주얼 빛. 이 장점은 특정 염료 또는 프로브 얼룩으로 셀 이동, 조직, 확산, 그리고 차별화 및 따라서 그들의 특정 세포 기능의 어떤 개발 공부를 크게 사용 되었다. 또한,이 작품에서 우리는 쉽게 연골 조직으로 확장 된 인간의 관절 chondrocytes의 redifferentiation를 공부 하는이 시스템의 좋은 성능을 설명 합니다. 셀 자체 펩 티 드 건설 기계 조립으로 캡슐화 되었고 chondrogenesis를 홍보 하기 위해 특정 조건 하에서 경작. 3 차원 문화 실험의 4 주 동안 좋은 생존을 보여주었다. 예상 했던 대로, chondrogenic inducers (비 유발 컨트롤에 비해)와 교양 톨루이 파랑 (이 얼룩 있다 (개 그) 높은 연골 기질에 존재 하는) 강하게 긍정적인 얼룩이 샘플과 표현 콜라겐을 포함 한 특정 분자 마커는 서쪽 오 점 분석에 따라 I, II 및 X을 입력 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 수행 하 고 연구 실험실, 산업에서 실험실 과정에서 교육 목적을 위해 사용 될 수 있습니다.
많은 십 년간 동안 포유류 세포 배양 비 생리 적인 측면에 실용적이 고 경제적인 문제로 고전 2 차원 (2D) 문화 시스템을 사용 하 여 실험 조건 하에서 수행 되었습니다. 이 문화 시스템 연구 하 고 가장 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 데 도움이, 비록 우리가 알고 오늘 새로운 셀 문화 패러다임 더 복잡 한 셀룰러 시스템을 공부 하는 데 필요한. 따라서, 3 차원 (3D) 문화 시스템은 biophysically, biomechanically microenvironment를 재현 하는 데 필요한 및 생물학 더와 비슷한 자연 조직. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 시스템, 일반적으로 연구자 및 업계 중 더 널리 연구의 새로운 모델을 대표 하기 때문 또는 마이그레이션할 셀 공간에서 성장, 셀 셀을 만들 수 있습니다 또는 셀 매트릭스 상호 작용에서 심사 및 결국 특정 셀 혈통으로 구분 합니다.
이 방법론의 전반적인 목표는 체 외에서 세포 microenvironment vivo에서 microenvironment에 가까이 그를 다시 것입니다. 특히, 합성 자가 조립 펩 티 드 비 얼 (간)은 소재 독특한 속성; 그것은 나노미터 크기의 숨 구멍 만들어 기계적, 구조적 특성을 가진 펩 티 드 간의 약한 상호 작용 비슷한 자연 세포 외 매트릭스의 그의 네트워크를 형성. 즉,이 자료의 사용의 뒤에 합리 성 이다는 그것은 진정한 3D 환경을 만드는 의사 3D 조직 또는 기관 단위에 이상적입니다. 그러나, 가장 중요 한 것은, 3D 컨텍스트 수 있습니다 일반적으로 존재 하지 않습니다 2D 문화 플랫폼, 조직 구조, 대량 전송 현상에 관련 된 속성 셀 패턴화와 같은 새로운 생물 학적 기능을 얻기 위해 3 차원 구조와 결국 미래 연구 및 개발 기능 조직 및 장기1,2의 중요 한 요소는 조직 morphogenesis 또한, 그들의 자연적인 대조 물 (콜라겐, Matrigel) 얼 간의 이점을입니다 그들은 실 온에서 매우 안정 하 고 포스트 프로덕션, 배포 또는 저장3,4, 에 대 한 특별 한 조건을 요구 하지 않습니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 얼 간은 쉽게 처리 때; 이온 강도 증가 하거나 중립1,2로 pH를 조정 하 여 3D 젤 단순히 얻어질 수 있다. 마지막으로, 여기에 설명 된 방법을 광범위 하 게 사용 되었습니다 체 외에 유지 보수, 성장과 chondrocytes, hepatocytes, 내 피 세포, osteoblasts, 신경 세포도 세포 유형의 숫자의 차별화 홍보 체세포 배아 줄기 세포3,,45,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 현재 일에서 우리는 앞에서 설명한11으로 연골 같은 조직으로 인간의 확장된 관절 chondrocytes (액세서리)를 차별화 하는 3D 문화 시스템의 사용 설명.
여기, 얼 간 사용 하는 3D 시스템에 문화 세포 하는 방법을 설명 합니다. 이 합성 소재에 셀 셀 주위 nanometric 크기의 네트워크를 만들고 따라서 진정한 3D 환경 (그림 1)을 만드는 먼저 연속적으로 자체 조립 하 유도 된 펩타이드 솔루션으로 혼합 됩니다. 그것은 세포질 행동 매트릭스 강성 값 (즉, 확산, 마이그레이션 및 차별화)에 의해 영향을 고려 하는 것이 중요. 따라서, 일반적인 방법론 컨트롤 같은 강성 값 (두 가지 차원에서 문화) 펩 티 드 비 계 위에 문화 셀 것입니다.
이전에 우리 그룹 등 다양 한 셀 시스템3,,45,6,7,8 3 차원 (3D) 문화 플랫폼의 사용을 묘사 했다 9,10,11,12,13,,1415. 현재 작업에서 우리는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법 설명 3D 문화를 얻는 시스템을 포함 한 모든 종류의 기능 세포, 배아 또는 성인 포유류 세포의 모든 종류에 적용 되는 줄기 세포, 또는 역 기능 셀에서 격리 하는 결국, 생 검 또는 종양, 그리고에. 또한, 독립적으로, 줄기 세포는 배아 또는 성인의 경우 그들은 했을 하지 더 나은 계보 투입 용량 클래식 2D 문화 요리10,11,12,보다 3D 환경에서 13,,1415. 따라서,이 시스템에서 셀 문화 회복 또는 재생 의학 독물학 및 약리 플랫폼에서 다른 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 기능적 조직 같은 구조로 차별화를 끌 것 이다.
우리 세포 microenvironment는 자연 조직 매트릭스 구조와 biomechanical, 생물 및 생물 학적 매개 변수의 유사 때문에 세포 기능에 명확한 이득으로 나타났습니다. 그럼에도 불구 하 고, 시스템이 더 복잡해, 되어야 하는 매개 변수 수 규제 또한 증가, (대량 전송 현상에 관련 된 문제를 방지 하려면 활성 관류 시스템 등 외부 지원 플랫폼에 대 한 필요성을 포함 하 ). 3 차원으로 배양된 세포 이동, 확산 및 감 별 법 등 필수적인 활동 규제 측면에서 더 나은 수행 합니다. 그들은 향상 된 셀룰러 누화는 지금까지 성장 하 고 3D에 차별화의 필수 결과 허용 하는 복잡 한 네트워크를 형성할 수 있습니다. 얼 간 사실은 비슷한 효과의 합리적인 연구 이후 이점을 발판 (성장 인자, 다 당 류 또는 신호에 추가 하는 각 구성 요소에 대 한 생산 세포 외 기질 단백질 나타냅니다 그 생체 외에서 조건을 만들 수 있습니다. 펩 티 드) 밖으로 쉽게 실행 될 수 있습니다.
얼 간이에 비해 다른 자연 건설 기계 같은 콜라겐 타입 I과 Matrigel의 사용의 명확한 장점은 다음: 1) 얼 간은 일괄 처리에서 일괄 생산;에 최소한의 변형으로 합성 소재 2) 얼 간이에 특정 펩 티 드 모티브; 기능성 수 용량이 그리고 3) 얼 간 선물 biodegradability에서 생체 외에서시간이 지남에 같은 생물, biomechanical 및 구조 속성 가진 3 차원 구조물의 유지 관리를 허용 하는 낮은. 그러나, 사용의 제한 대 다른 얼 간 건설 기계 세포 적대적인 환경 때문에 낮은 pH에서에서가 캡슐화 단계 중 발견. 따라서, 이것은 기술된 방법론에 중요 한 단계 이다. 또한, 그것은 어떤 실험을 시작 하기 전에 각 특정 셀 형식에 대 한 얼 간 농도 설정 하는 것이 중요입니다. 이것은, 실제로, 필수 때 셀 교양 또는 이러한 생체에 있기 때문에 각 특정 셀 형식을 최적의 biomechanical 성장 상태를 발표할 예정 이다.
마지막으로, 우리는 설계 및 제조의이 유형의 소재 비 계 제약 산업에 대 한 더 나은 치료 접근을 개발 하는 데 도움이 더 많은 생리 적이 고 신뢰할 수 있는 3 차원 조직 모델의 개발을 향상 것 믿으십시오 재생 의학, 암 또는 어떤 치료입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자에 의해 수행 연구 부여 계약 번호 229239, 아래 유럽 연합 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 그리고 예비 연구 공동 연구 프로그램 급성 AO 재단에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 연골 부상/변/결함 (CRP ACI) 프로젝트 Bioactive 그리고 Biomimetic 건설 기계 연골 재생 (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |