Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.
Una tecnica utile per la coltura di cellule in nanofibra autoassemblanti impalcatura tridimensionale (3D) è descritto. Questo sistema di coltura ricrea un ambiente che imita molto attentamente le caratteristiche strutturali del tessuto non polarizzato. Inoltre, la struttura particolare nanofibra intrinseco dell’impalcatura rende trasparente alla luce visibile, che consente una visualizzazione semplice del campione al microscopio. Questo vantaggio è stato ampiamente utilizzato per studiare la migrazione cellulare, organizzazione, proliferazione e differenziazione e così qualsiasi sviluppo della loro particolare funzione cellulare mediante colorazione con coloranti specifici o sonde. Inoltre, in questo lavoro descriviamo la buona prestazione di questo sistema per studiare facilmente la redifferentiation di espanso chondrocytes articolari umani in tessuto cartilaginoso. Cellule erano incapsulate in auto-assemblanti peptide impalcature e coltivate in condizioni specifiche per promuovere chondrogenesis. Le colture tridimensionali hanno mostrato buona redditività durante le 4 settimane dell’esperimento. Come previsto, campioni coltivati con induttori condrogenica (rispetto ai controlli non indotta) macchiato forte positivi per il blu di toluidina (che le macchie di glicosaminoglicani (gag) che sono altamente presenti nella matrice extracellulare della cartilagine) ed espresso marcatori molecolari specifici, tra cui collagene di tipo I, II e X, secondo analisi Western Blot. Questo protocollo è facile da eseguire e può essere utilizzato in laboratori di ricerca, industrie e per scopi didattici nei corsi di laboratorio.
Per molti decenni, coltura delle cellule dei mammiferi è stata eseguita in condizioni sperimentali, utilizzando sistemi di classica cultura bidimensionale (2D) a causa di problemi pratici ed economici indipendentemente gli aspetti non-fisiologica. Anche se questo sistema cultura aiuta a studiare e capire di più i meccanismi cellulari e molecolari, che conosciamo oggi sono necessari nuovi paradigmi di coltura delle cellule per studiare più complessi sistemi cellulari. Pertanto, sistemi tridimensionali (3D) cultura sono necessari per ricreare un microambiente che è biofisicamente, biomeccanico e biologicamente più simile a quella dei tessuti naturali. Negli ultimi anni, sistemi di coltura 3D, in generale, sono diventati più diffusi tra i ricercatori e l’industria rappresentano un nuovo modello di studio o di screening in cui le cellule possono crescere nello spazio, creare cellula–cellula o interazioni cellula-matrice, la migrazione e alla fine di differenziarsi in linee cellulari specifici.
L’obiettivo generale di questa metodologia è quello di ricreare un in vitro microambiente cellulare che è più vicino al microambiente in vivo . In particolare, lo scaffold sintetico di peptide autoassemblanti (SAPS) è un tipo di biomateriale con proprietà uniche; forma una rete di pori di dimensioni nanometriche fatto di interazioni deboli tra peptidi con proprietà meccaniche e strutturali simili quelli di matrici extracellulari naturale. In altre parole, la razionalità dietro l’uso di questo materiale è che crea un ambiente veramente 3D che è ideale per ottenere tessuti di pseudo-3D o unità di organo. Tuttavia, la cosa più importante, il contesto 3D permette di acquisire nuove funzioni biologiche che normalmente non sono presenti nelle piattaforme 2D cultura, come proprietà relazionati all’architettura dei tessuti, fenomeni di trasferimento di massa, cella patterning la struttura 3D e alla fine morfogenesi dei tessuti, che sono fattori chiave nella ricerca futura e nello sviluppo di tessuti funzionali e organi1,2. Inoltre, un vantaggio di SAPS sopra le loro controparti naturali (collagene, Matrigel) è che sono molto stabili a temperatura ambiente e non richiedono particolari condizioni di post-produzione, distribuzione o archiviazione3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS è facile da gestire, quando lo si desidera; 3d gel può essere ottenuta semplicemente aumentando la forza ionica o regolando il pH a neutralità1,2. Infine, la metodologia descritta qui è stato ampiamente utilizzato in vitro per promuovere la manutenzione, la crescita e la differenziazione di un certo numero di tipi di cellule, tra cui gli epatociti, cellule endoteliali, osteoblasti, condrociti, cellule neuronali pure come cellule staminali embrionali e somatiche3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. nel lavoro attuale, descriviamo l’uso di un sistema 3D-cultura a differenziarsi chondrocytes articolari espanso umani (hACh) in cartilagine-come il tessuto come descritto in precedenza11.
Qui, è descritto un metodo per cellule di cultura in un sistema 3D utilizzando SAPS. In questo biomateriale sintetico, cellule prima sono mescolate con una soluzione di peptide, che è successivamente indotto di auto-assemblarsi, creando una rete di dimensioni nanometriche intorno alle cellule e quindi creare un ambiente veramente 3D (Figura 1). È importante considerare che il comportamento cellulare è interessato da valori di rigidezza di matrix (vale a dire, proliferazione, migrazione e differenziazione). Di conseguenza, un controllo metodologico comune è quello di cellule di cultura in cima l’impalcatura del peptide con gli stessi valori di rigidità (cultura su due dimensioni).
In precedenza, il nostro gruppo ed altri hanno descritto l’uso di piattaforme di tridimensionale (3D) cultura con cella diversi sistemi3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Nel lavoro attuale, descriviamo un metodo facile e affidabile di ottenere cultura 3D sistemi che sono applicabili a qualsiasi tipo di cellule di mammiferi tra cui qualsiasi tipo di cellula funzionale, embrionale o adulto cellule staminali, o alla fine, le cellule disfunzionali isolate da le biopsie o tumori e così via. Inoltre, in modo indipendente, se le cellule staminali sono di origine embrionale o adulto avrebbero una migliore capacità di impegno di lignaggio nell’ambiente 3D che in 2D classica cultura piatti10,11,12, 13,14,15. Di conseguenza, la coltura delle cellule in questo sistema porterebbe alla differenziazione in funzionale tessuto-come le strutture che potrebbero essere utilizzate in svariate applicazioni, dalla biomedicina riparativa o rigenerativa per piattaforme tossicologiche e farmacologiche.
Abbiamo dimostrato un chiaro aumento nella funzione delle cellule perché il microambiente cellulare è simile a quella dei tessuti naturali in termini di struttura matrix e parametri biomeccanici, biofisici e biologici. Tuttavia, come il sistema diventa più complesso, il numero di parametri che devono essere regolati anche aumenti, che comprende la necessità di una piattaforma di supporto esterna (ad esempio di un sistema di perfusione attiva per evitare problemi associati a fenomeni di trasferimento di massa ). Cellule coltivate tridimensionalmente le prestazioni migliori in termini che regolano le attività essenziali, quali la migrazione, proliferazione e differenziazione. Potrebbe formano reti complesse consentendo diafonia cellulare avanzata, che è di gran lunga una conseguenza essenziale di crescita e di differenziazione in 3D. Il fatto che i succhi potrebbe creare condizioni in vitro simile a quelle della matrice extracellulare proteine rappresenta un vantaggio poiché uno studio razionale dell’effetto prodotto per ogni componente aggiunto al patibolo (fattore di crescita, polisaccaride o segnalazione peptide) potrebbe essere facilmente portato.
I chiari vantaggi dell’uso di SAPS rispetto ad altri scaffold naturali, come collagene di tipo I e Matrigel, sono i seguenti: 1) SAPS è un biomateriale sintetico con minime variazioni da lotto a lotti di produzione; 2) SAPS ha la capacità di essere funzionalizzati con motivi di peptide specifico; e 3) presenta SAPS bassa biodegradabilità in vitro, che permette il mantenimento del costrutto 3D con le stesse proprietà biofisiche, biomeccaniche e strutturali nel corso del tempo. Tuttavia, la limitazione dell’utilizzo di SAPS contro altri ponteggi è trovato durante la fase di incapsulamento, dove le cellule sono in un ambiente ostile a causa del basso pH. Pertanto, questo è un passaggio fondamentale nella metodologia descritta. Inoltre, è importante impostare la concentrazione di SAPS per ciascun tipo di cella specifica prima di iniziare qualsiasi esperimento. Questo è, infatti, essenziale quando le cellule sono coltivate su o dentro questi biomateriali, poiché ogni tipo di cellula particolare presenterà condizioni di crescita ottimali biomeccanico.
Infine, riteniamo che la progettazione e la fabbricazione di questo tipo di ponteggio biomateriale potrebbe migliorare lo sviluppo di modelli 3D del tessuto più fisiologiche ed affidabili per aiutare l’industria farmaceutica a sviluppare migliori approcci terapeutici per medicina rigenerativa, cancro o qualsiasi trattamento medico.
The authors have nothing to disclose.
La ricerca effettuata dagli autori è stata sostenuta in parte da sovvenzioni dall’Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto Grant accordo n. 229239 e dalla Fondazione AO, esplorativo ricerca collaborativa ricerca programma acuta Cartilagine ferita/lesione/difetto (CRP ACI) nell’ambito del progetto Bioactive e biomimetici scaffold per la rigenerazione della cartilagine (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |