Özet

Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade

Published: March 30, 2018
doi:

Özet

O protocolo atual apresenta procedimentos experimentais para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidade de libertar moleculares fatores que promovem o crescimento do axônio. Tratamento de acampamento para as culturas de macrófagos neurônio co induz os macrófagos para produzir meio condicionado que possui atividade de consequência natural do axônio forte.

Abstract

Há fortes evidências de que os macrófagos podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso. Aqui, descrevemos um protocolo em que os macrófagos são induzidos a produzir condicionado médio (CM) que promove o crescimento do axônio. Neurônios do gânglio (DRG) adulto raízes dorsais são agudamente dissociados e chapeados. Depois que os neurônios estão conectados estàvel, macrófagos peritoneais são cultivados co em uma inserção de cultura celular sobreposta sobre o mesmo bem. Dibutyryl que amp cíclico (cAMP-db) é aplicado às culturas co por 24 h, após o qual a cultura de pilha inserir contendo os macrófagos é movido para outro poço para coletar CM por 72 h. O CM de co culturas tratadas com db-cAMP, quando aplicado a uma cultura de neurônio DRG adulta separada, apresenta atividade de consequência natural do axônio robusto. O CM obtido a partir das culturas db-cAMP-tratados, consistindo de um único tipo de células sozinho, ou neurônio DRG ou macrófago peritoneal, não apresentam atividade de consequência axônio. Isso indica que a interação entre os neurônios e macrófagos é indispensável para a ativação de macrófagos secretando fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio em centímetros. Assim, nosso paradigma de co-cultura também será útil para estudar a sinalização intercelular na interação neurônio-macrófago para estimular os macrófagos para ser dotado de um fenótipo pro-regenerativa.

Introduction

Diversos estudos têm buscado melhorar a regeneração de axônio CNS após as lesões da medula espinhal ou cérebro. Reações inflamatórias, inevitavelmente, que acompanham as lesões no sistema nervoso, tradicionalmente são pensadas para participar em processos patológicos secundários, levando a resultados deletérios1,2. Com efeito, metilprednisolona que pode suprimir reações inflamatórias é a única terapia aprovada para de lesão medular aguda3. No entanto, estudos mais recentes forneceram evidências que macrófagos, um tipo de células inflamatórias representativo, podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso4,5,6. Por exemplo, infiltração de macrófagos que seguindo uma lente lesão produzir pro-regenerativa as moléculas para promover a regeneração de neurônios ganglionares da retina7,8. Além disso, transplantados neurônios DRG aumentaram o crescimento do axônio na região onde os macrófagos foram activados por ZnPPIX9. Além disso, os macrófagos, no local da lesão podem criar um meio de crescimento-permissivo por nervos periféricos feridos10.

Nosso trabalho também forneceu fortes evidências que os macrófagos podem contribuir para a capacidade de regeneração do axônio nos neurônios adjacentes. Temos demonstrado que a ativação de macrófagos no gânglio da raiz dorsal (DRG) foram essenciais na reforçada capacidade regenerativa de DRG neurônios sensoriais seguindo um pré-condicionamento periférica nervo lesão11. Pesquisa semelhante foi relatada independentemente de outro laboratório12. Também mostramos que a injeção intraganglionic de dibutyryl do AMP cíclico (cAMP-db), que é uma molécula bem conhecida para aumentar a capacidade de regeneração do axônio13, induziu a ativação de macrófagos. A desativação de macrófagos aboliu os efeitos da db-acampamento na atividade de consequência natural do axônio. Trabalhos posteriores identificaram induzida por lesão expressão CCL2 nos neurônios como um sinal para estimular macrófagos com fenótipo regenerativos pro14,15.

Com base em resultados experimentais acima, nós estabelecemos um modelo in vitro assemelhando-se a eventos moleculares que ocorrem nos DRGs seguindo um pré-condicionamento lesão modelo11,14. Neste modelo, db-cAMP é aplicado para as culturas co neurônio-macrófago provocando intercelular de sinalização que leva à ativação de macrófagos com um fenótipo pro-regenerativa. Aqui, descrevemos protocolos detalhados, pelo qual podemos gerar os macrófagos que secretam fatores moleculares promovendo consequência axônio (Figura 1). Este modelo experimental ilustra um conceito que macrófagos podem ser estimulados ou induzidos a apoiar a regeneração do axônio após as lesões ao sistema nervoso. Nosso modelo também será útil no estudo de mecanismos de sinalização intercelular que leva à ativação de macrófagos pro-regenerativa.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e uso Comitê de Ajou University School of Medicine. 1. cultura preparação de neurônio dissociada DRG adulto Antes de configurar a cultura, pre-revesti uma placa de 6 com poli-D-lisina e laminina. Incube uma placa de 6 com 0.01% poli-D-lisina a 37° C por 2 h ou a 4° C durante a noite. Em seguida, lave a placa duas vezes com água destilada. Incubar a placa com solução de lamini…

Representative Results

Descreveremos um protocolo que pode gerar os macrófagos capazes de secretar fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio. O macrófago CM obtido a partir da co culturas tratadas com db-acampamento resultou em consequência do axônio robusto quando aplicado a uma cultura separada de neurônio DRG (Figura 2A). Em comparação, CM obtido a partir das culturas co tratada com PBS não induzir axônio consequência em nossa duração de c…

Discussion

Existem várias etapas críticas para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que os neurônios de rato DRG e macrófagos peritoneais são preparados frescos e saudáveis. Nós experimentamos o axônio reduzida atividade de consequência natural do CM quando a dissecação de todos os DRGs levou mais de 30 min. Além disso, a contaminação dos componentes do sangue em macrófagos peritoneais também levou a uma diminuição da atividade de consequência natural do axônio no CM. Lavagem completa…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este protocolo é suportado por um fundo NRF-2015R1A2A1A01003410 do Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro, República da Coreia.

Materials

Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size Corning,Falcon 353090 Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer Corning, Falcon 352350
8-well culture slide Biocoat 354632 with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer Qiagen 158904
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9407-100MG
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific, Gibco 21103-049 Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free Thermo Fisher Scientific, Gibco 17504-044 extracellular solution
Glutamax Thermo Fisher Scientific, Gibco 35050-061
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific, Gibco 15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407-5MG
Laminin Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt Merck Millipore Corporation, Calbiochem 28745
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 16210072
Triton-X-100 Daejung Chemical and Metal Co 8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1) Promega Corporation G7121 Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen A11005
Hemacytometer Marienfeld-Superior N/A
Cell culture CO2 incubator Panasonic N/A
Dissecting stereomicroscope Carl Zeiss Stemi DV4
Twist shaker FINEPCR Tw3t
Tabletop centrifuge Sorvall N/A
Confocal microscope Olympus America Inc IX71
FBS (Fetal Bovine Serum) VWR International, Hyclone SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs FST (Fine Science Tools) 16021-14 Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut FST (Fine Science Tools) 14558-11 sharp, serrated
Dumont #7 Forceps FST (Fine Science Tools) 11272-30 Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors FST (Fine Science Tools) 15000-00 straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge Artisan Technology Group DW-41 Input Voltage: 115VAC

Referanslar

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Yun, H. J., Kim, E., Kim, B. G. Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity. J. Vis. Exp. (133), e56920, doi:10.3791/56920 (2018).

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