Özet

נוירון-מקרופאג תרבויות שותפה להפעלת מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר Neurite

Published: March 30, 2018
doi:

Özet

בפרוטוקול הנוכחי מציג ניסיוני ההליכים כדי להמריץ מקרופאגים בתרבית כדי להיות ניחן היכולת לשחרר מולקולרי גורמים המקדמים neurite תוצר. טיפול של מחנה לתרבויות המשנה נוירון-מקרופאג המניע את המקרופאגים לייצר בינוני ממוזגים שמחזיק neurite חזק תוצר פעילות.

Abstract

יש ראיות חזקות מקרופאגים יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו המקרופאגים הם המושרה לבינונית התוצרת ממוזגים (ס מ) המקדמת תוצר neurite. שורש העזוב למבוגרים גנגליון (DRG) נוירונים בחריפות הפומבית, מצופה. לאחר הנוירונים stably מחוברים, מקרופאגים הצפק הם שיתוף בתרבית על הוספה תרבות תאים בשכבות על אותו טוב. Dibutyryl שמחזורי AMP (db-מחנה) מוחל על התרבויות שותף במשך 24 שעות, לאחר מכן להוסיף התרבות התא המכיל את המקרופאגים מועבר היטב אחר כדי לאסוף ס מ עבור 72 h. ס מ התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה, כאשר חל נפרדות למבוגרים DRG נוירון תרבות, תערוכות פעילות תוצר neurite חזקים. ס מ שהתקבל מן התרבויות db מחנה-שטופלו המורכב סוג תא בודד לבד, DRG נוירון או מקרופאג הצפק, לא להפגין פעילות תוצר neurite. אפשרות זו מציינת כי האינטראקציה בין הנוירונים ו מקרופאגים היא הכרחית עבור ההפעלה של מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite ס מ. לפיכך, הפרדיגמה תרבות משותפת שלנו גם יהיה מועיל ללמוד איתות המערכת באינטראקציה נוירון-מקרופאג כדי לגרות את המקרופאגים כדי להיות ניחן הפנוטיפ משובי pro.

Introduction

מגוון רחב של מחקרים ניסו לשפר את מערכת העצבים המרכזית האקסון חידוש לאחר הפציעות של חוט השדרה או המוח. תגובות דלקתיות, באופן בלתי נמנע המלווה את הפגיעה במערכת העצבים, נחשבים באופן מסורתי להשתתף משני תהליכים פתולוגיים שמוביל התוצאות המזיקות1,2. אכן, מתילפרהדניזולון יכול לדיכוי תגובות דלקתיות הוא הטיפול היחיד שאושרו עבור פגיעה בחוט השדרה חריפה3. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר סיפקו ראיות כי מקרופאגים, סוג תאים דלקתיים נציג, יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים-4,5,6. לדוגמה, שחדר מקרופאגים בעקבות של עדשה פציעה תוצרת פרו משובי מולקולות רגנרציה של גנגליון נוירונים7,8. בנוסף, נוירונים DRG המושתלים גדל האקסון הצמיחה את האזור שבו מקרופאגים הופעלו על ידי zymosan9. יתר על כן, המקרופאגים באתר הנגע יכול ליצור וחשש צמיחה-מתירני העצבים ההיקפיים נפגעים10.

העבודה שלנו גם סיפק ראיות חזקות מקרופאגים יכול לתרום הקיבולת של האקסון התחדשות של נוירונים סמוכים. הראינו כי ההפעלה של מקרופאגים, הגרעינים העזוב שורש (DRG) היו חיוניים ביכולת הרגנרציה משופרת של DRG החישה הניריונים בעקבות היקפי preconditioning עצב פציעה11. מחקר דומה נמסר באופן עצמאי מן המעבדה עוד12. גם הראנו כי הזרקת intraganglionic dibutyryl מחזורי AMP (db-מחנה), אשר הוא מולקולה ידועים כדי לשפר את היכולת של האקסון התחדשות13, המושרה את ההפעלה של מקרופאגים. שחרור משרות של מקרופאגים ביטל את ההשפעות של db-מחנה על פעילות תוצר neurite. עבודות עוקבות זיהו פגיעה-induced ביטוי CCL2 בנוירונים בתור אות להמריץ מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro14,15.

בהתבסס על תוצאות הניסוי הנ ל, הקמנו במבחנה מודל הדומה האירועים המולקולריים המתרחשים DRGs בעקבות preconditioning פגיעה דגם11,14. במודל זה, db-מחנה מוחל על התרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג העלאת המערכת איתות. שמוביל ההפעלה של מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט שבו אפשרי לייצר המקרופאגים להפריש מולקולרי גורמים קידום neurite תוצר (איור 1). מודל ניסיוני זה ממחיש רעיון כי מקרופאגים יכול להיות מגורה או המושרה לתמוך התחדשות האקסון בעקבות הפציעות למערכת העצבים. המודל שלנו גם יהיה שימושי בלימוד מנגנוני איתות המערכת שמוביל ההפעלה של מקרופאגים משובי pro.

Protocol

כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על ידי מוסדיים חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של ד אלעג’ו הספר לרפואה של אוניברסיטת. 1. תרבות הכנה של נוירון הפומבית DRG למבוגרים לפני הגדרת התרבות, מעיל מראש צלחת 6-ובכן עם פולי-D-ליזין ו laminin. דגירה צלחת 6-ובכן עם 0.01% פולי-D-ליזין ב 37 מעלות צלזיו…

Representative Results

אנו מתארים פרוטוקול שיכולות לייצר מקרופאגים מסוגל הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite. מקרופאג ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה הביא תוצר neurite חזקים כאשר חל על תרבות נוירון DRG נפרד (איור 2 א). לשם השוואה, ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו PBS…

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים עבור הדור של מערכת זו תרבות משותפת. זה חשוב להבטיח העכבר DRG נוירונים ו מקרופאגים הצפק מוכנים טרי ובריא. שאנו חווים neurite מופחתת פעילות תוצר של ס מ ניתוח כל DRGs לקח יותר מ 30 דקות. בנוסף, הזיהום של רכיבי הדם מקרופאגים הצפק גם הובילו לירידה של neurite תוצר פעילות ס מ. כדי להפיק נ…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק ה-NRF-2015R1A2A1A01003410 משרד המדע, טכנולוגיית מידע, תכנון העתיד, הרפובליקה של קוריאה.

Materials

Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size Corning,Falcon 353090 Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer Corning, Falcon 352350
8-well culture slide Biocoat 354632 with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer Qiagen 158904
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C9407-100MG
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific, Gibco 21103-049 Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free Thermo Fisher Scientific, Gibco 17504-044 extracellular solution
Glutamax Thermo Fisher Scientific, Gibco 35050-061
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific, Gibco 15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6407-5MG
Laminin Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt Merck Millipore Corporation, Calbiochem 28745
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 16210072
Triton-X-100 Daejung Chemical and Metal Co 8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1) Promega Corporation G7121 Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen A11005
Hemacytometer Marienfeld-Superior N/A
Cell culture CO2 incubator Panasonic N/A
Dissecting stereomicroscope Carl Zeiss Stemi DV4
Twist shaker FINEPCR Tw3t
Tabletop centrifuge Sorvall N/A
Confocal microscope Olympus America Inc IX71
FBS (Fetal Bovine Serum) VWR International, Hyclone SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs FST (Fine Science Tools) 16021-14 Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut FST (Fine Science Tools) 14558-11 sharp, serrated
Dumont #7 Forceps FST (Fine Science Tools) 11272-30 Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors FST (Fine Science Tools) 15000-00 straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge Artisan Technology Group DW-41 Input Voltage: 115VAC

Referanslar

  1. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  2. Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
  3. Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
  4. Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
  5. DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
  6. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
  7. Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
  8. Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
  9. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  10. Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
  11. Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
  12. Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
  13. Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
  14. Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  15. Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
  16. Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
  17. Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
  18. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Yun, H. J., Kim, E., Kim, B. G. Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity. J. Vis. Exp. (133), e56920, doi:10.3791/56920 (2018).

View Video