Özet

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

Published: March 30, 2018
doi:

Özet

Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.

Abstract

De aleurone laag van gerst korrels is een belangrijk model-systeem voor hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten. In de aleurone cellen, genen nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling worden geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De mechanismen van GA en ABA signalering kunnen worden ondervraagd door de invoering van reporter gene constructies in aleurone cellen via deeltje bombardement, met de daaruit voortvloeiende voorbijgaande expressie gemeten met behulp van enzym testen. Een verbeterde protocol wordt gemeld dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de korrel homogenisering stap en de enzym-vitrotests, waardoor aanzienlijk meer doorvoer dan bestaande methoden. Homogenisering van de korrel monsters wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde weefsel homogenizer en GUS (β-glucuronidase) tests worden uitgevoerd met behulp van een 96-Wells plaatsysteem. Representatieve resultaten met behulp van het protocol suggereren dat fosfolipase D activiteit kan een belangrijke rol in het activeren van HVA1 genexpressie door ABA, door middel van de transcriptiefactor TaABF1.

Introduction

De laag van de aleurone gerst is een gevestigde modelsysteem voor de studie van hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten1. In het bijzonder worden een aantal genen die nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De GA en ABA signalering trajecten met elkaar verweven zijn, zoals de expressie van bepaalde genen GA-geactiveerd wordt geremd door ABA en vice-versa1.

Een waardevolle strategie voor begrip van dat de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering is de invoering van effector gene constructies via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies waarmee het resulterende effect op stroomafwaarts genexpressie te bepalen. Het gebruik van verslaggever genen zoals GUS (β-glucuronidase) of Luciferase maakt de gevoelige en kwantitatieve meting van genuitdrukking specifiek binnen de cellen die de effector constructie hebben ontvangen. Bijvoorbeeld, vastgesteld de invoering van een effector construct codering van de transcriptiefactor TaABF15,6 dat ABA-geïnduceerde genen zoals HVA1 door TaABF1, terwijl de GA-geïnduceerde genen zoals Amy32b veroorzaakt worden onderdrukt. Bombardement van het deeltje als een experimentele strategie hanteert voor het onderzoeken van de diverse aspecten van GA/ABA signalering door meerdere laboratoria. Dergelijk werk heeft geleid tot de identificatie van de promotor elementen belangrijk voor de activering van zowel de GA-geïnduceerde2 en de ABA-geïnduceerde genen3, en tot de ontdekking van eiwit kinases4 en transcriptie factoren5 die regelen de expressie van deze genen.

De bestaande protocollen2,3,4,5,6 voor deeltje bombardement en de daaropvolgende meting van voorbijgaande genexpressie zijn heel arbeidsintensief, zoals elke set gebombardeerd nauwelijks korrels is gehomogeniseerd met de hand in een mortier en een stamper en het enzym testen afzonderlijk worden uitgevoerd. Dit manuscript rapporten in een verbeterde protocol dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de homogenisering stap en de GUS testen zodat aanzienlijk meer doorvoer, waardoor een groter aantal behandelingen in hetzelfde experiment, worden getest en/of de opneming van meer replicatieonderzoeken voor elke behandeling om meer statistisch robuuste resultaten te verkrijgen. Representatieve resultaten worden weergegeven voor de expressie van HVA1 tr Amy32b verslaggever constructies, gereguleerd door de transcriptiefactor TaABF1 alsmede door GA, ABA, en andere regelgevende moleculen.

Protocol

1. bereiding van Effector en Reporter Gene construeert Bouwen effector constructies die een constitutief promotor (bijv. maïs ubiquitin, UBI dienst) op station expressie van een gewenste open leesraam. Bijvoorbeeld, bouw een plasmide met UBI::TaABF1 tot station sterke constitutieve uitdrukking van TaABF15. Bouwen verslaggever constructies waarin de promotor waarvan de activiteit is te worden gemeten, voorafgaand aan een open leesraam, zoals GUSgeplaa…

Representative Results

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om elke test gene construct in aleurone cellen van gerst korrels. Het niveau van expressie van het test-gen kan vervolgens worden gemakshalve gemeten (Figuur 2). Het hogere doorvoer protocol beschreven hier sterk verhoogt de efficiency van de zaad slijpen en enzym assay stappen. Deze methode is gebruikt voor de beoordeling van het vermogen van de transcriptie factor TaABF15,<su…

Discussion

De invoering van effector gen construeert via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies is een waardevolle strategie voor het ontleden van de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering en in het resulterende hormoon-gereglementeerde gen expressie.
Bestaande protocollen voor het uitvoeren van dergelijke experimenten in gerst aleurone cellen2,3,4,5<…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Greyson Butler en Margaret Barrett voor hulp bij de uitvoering van de experimenten, Judy Stone voor advies over graan homogenisering en Lynn Hannum voor advies over fluorometry. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (IOB 0443676), door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health subsidie onder nummer P20GM0103423, en door toelagen van de verdeling van het Colby College van natuurwetenschappen.

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

Referanslar

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

View Video