En utilisant un dispositif microfluidique pour une Stimulation mécanique et l’imagerie haute résolution de c. elegans

Le sens du toucher fournit des animaux avec des informations cruciales sur leur environnement. Selon la force appliquée, touch est perçue comme anodine, agréable ou douloureux. La déformation du tissu pendant touch est détectée par des cellules spécialisées mécanorécepteur incorporés dans la peau qui expriment des protéines réceptrices, plus couramment des canaux ioniques. Les étapes reliant la perception de la force à l’activation de canal ionique lors de toucher et de la douleur ne sont pas totalement comprises. Encore moins sait comment le tissu cutané filtres déformation mécanique et si les mécanorécepteurs détecter des changements dans la souche ou souligner^1,2,3. Cette lacune dans la compréhension découle, en partie, d’un manque d’outils appropriés pour appliquer les stimulations mécaniques précises à la surface de la peau d’un animal vivant tout en observant les réponses au niveau cellulaire. Considérant que la microscopie à force atomique a été largement utilisée pour appliquer et mesurer les forces dans des cellules isolées^4,5 et aussi à activer les récepteurs Piezo1 la vie des cellules⁶, des expériences similaires à l’aide d’animaux vivants, en particulier C. elegans, ont été notoirement difficile en raison de la mobilité intrinsèque du sujet. Traditionnellement, ce défi est contourné à l’aide de colle cyanoacrylate vétérinaire – ou -qualité chirurgicale pour immobiliser les animaux individuels sur gélose tampons^1,7,8,9. Cette approche a été productive, mais a des limites liées à la compétence requise pour l’immobilisation par collage et la surface de la gélose molle sur conformité mécanique. Une stratégie de microfluidique est une alternative gratuite qui permet d’éviter certaines des complications liées au collage.

Le nématode c. elegans est un organisme modèle génétique avec un système nerveux complètement mappé qui, en raison de la taille de l’animal, est un bon choix pour la technologie microfluidique. Dispositifs microfluidiques offre l’avantage que les animaux autrement extrêmement mobiles peuvent être immobilisés lors des opérations d’imagerie à haute résolution et livraison des stimuli neuro-modulateur pertinentes. Avec l’aide de microfluidique technologies, animaux vivants peuvent être immobilisés sans préjudice^10,11, permettant la surveillance de l’activité comportementale sur la vie entière^12,13 et haute résolution imagerie de l’activité neuronale^14,15,16,17. En outre, plusieurs neurones mécanorécepteur nécessaires pour le sens du toucher et de la douleur peut être caractérisé sur leur physiologique^1,8, mécanique^4,18,19et moléculaire niveau^20,21,22.

C. elegans détecte des stimuli mécaniques douces à son mur de corps à l’aide de six TRNs, dont trois innervent l’animal antérieur (ALML/R et AVM) et trois qui innervent postérieur de l’animal (PLML/R et PVM). Les molécules de canal d’ion nécessaires pour faire une force appliquée en un signal biochimique ont été largement étudiées dans son TRNs⁸. Cet article présente une plate-forme de microfluidique²³ qui permet aux chercheurs d’appliquer des forces mécaniques précis sur la peau d’un immobilisé c. elegans ascaris, lors de la lecture sur la déformation de ses tissus internes par imagerie optique. En plus de présenter des stimuli mécaniques bien définis, transitoires de calcium peuvent être enregistrés dans les neurones des mécanorécepteurs avec résolution subcellulaire et en corrélation avec les caractéristiques morphologiques et anatomiques. Le dispositif se compose d’un canal central de piégeage qui détient un seul animal et présente sa peau à côté de six canaux d’actionnement pneumatique (Figure 1 et Figure 2). Les six chaînes sont positionnés le long du canal de piégeage pour livrer des stimuli mécaniques à chacun de six TRNs du ver. Ces chaînes sont séparées de la chambre de piégeage par des diaphragmes PDMS minces, qui peuvent être actionnés par une source de pression de l’air extérieur (Figure 1). Nous avons calibré la déviation par rapport à la pression et fournissent les mesures obtenues dans cet article. Chaque actionneur peut être adressée individuellement et utilisée pour stimuler un mécanorécepteur de choix. La pression est livrée à l’aide d’une pompe à pression pilotée par piezo mais n’importe quel autre dispositif peut être utilisé. Nous montrons que le protocole de pression peut être utilisé pour activer TRNs in vivo et de démontrer le fonctionnement des appareils adaptés pour fournir des stimuli mécaniques aux adultes de c. elegans, chargement des animaux adultes dans des dispositifs, exécution d’imagerie calcique expériences et analyser les résultats. Fabrication de dispositifs consistant en deux étapes principales : 1) photolithographie pour faire un moule de SU-8 ; et 2) PDMS pour faire un dispositif de moulage. Par souci de concision et de clarté, le lecteur est prié de précédemment publié articles et protocoles^24,25 pour obtenir des instructions sur la façon de produire les moules et les périphériques.