מיומנות מטבולית של מערכות במבחנה ב הוא דרישת מפתח עבור biotransformation ומכירה של סמים toxicants. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של בדיקות מטבוליות התייחסות להעריך בשלב שאני המטבוליזם בתרביות תאים.
אנזימים חילוף חומרים Xenobiotic לשחק תפקיד מפתח biotransformation תרופות toxicants ידי הוספת קבוצות פונקציונליות המגבירים מסיסות ולהקל הפרשת. בהזדמנויות כמה שינויים מבניים אלו להוביל להיווצרות של מוצרים רעילים חדשים. על מנת להפחית ניסויים בבעלי החיים, סיכון כימי ניתן להעריך באמצעות תאים מוסמכים מבחינה מטבולית. הביטוי של אנזימים מטבוליים, לעומת זאת, אינו יציב לאורך זמן ברבות במערכות תרבות העיקרית במבחנה, והוא בדרך כלל חלקית או נעדר בשורות תאים. לכן, במחקר של תרופות, תוספים, וחילוף חומרים מזהמים סביבתיים במבחנה רצויה להתנהל במערכות תא שבו פעילות מטבולית התאפיינה. אנו מסבירים כאן גישה למדידת פעילות של מחלקה של אנזימים מטבוליים (Phase אנוש I) בשורות תאי 2D ותרבויות 3D ראשוני באמצעות בדיקות כימיות ומוצרי מטבולית שלהם לכימות על ידי ספקטרומטריית מסה UPLC וluminometry. השיטה ניתן ליישם על מנת לבחון את הפעילות המטבולית של שורות תאים תאים ראשוניים שמקורם במגוון של רקמות.
המטבוליזם Xenobiotic הוא התהליך שבאמצעותו כימיקלים זרים לגוף משתנים על ידי התוספת של קבוצות הידרופילי conjugates כדי להקל ההפרשה שלהם 1. בדרך כלל המטבוליזם של xenobiotics הוא תהליך דו-שלבי עם שלב I המורכב בעיקר של חמצון בתוספת קבוצות הידרוקסיל אחת או מספר 1, 2. בשלב ב ', קבוצות הידרוקסיל משמשים acceptors עבור המצומד הידרופילי כגון glucuronide או מחצית סולפט 1, 2. אם קבוצת acceptor כבר מקיימת על המולקולות, צעד הנטייה יכול לקרות עצמאי של חילוף חומרים שלב I. תגובה לכל מבוצעת על ידי קבוצה ספציפית של אנזימים, למשל, CYPs (ציטוכרום P450s), כי לזרז את hydroxylation (איור 1) ו dealkylation של מצעים כימיים 3. Conjugation מזורזת על ידי sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases (איור 1), גלוטתיון-S-טרנספראז ו- N-acetyltransferases 4. כל רקמה ואיבר יהיה פרופיל ביטוי אנזים ספציפי מטבולית, עם הכבד להביע ביותר של חלבונים אלו.
איור 1: דוגמה שלב I ושלב II ומטבוליזם עבור Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 לזרז את coumarin-hydroxylation 7 של. 7-hydroxycoumarin הוא מצומדות כדי מחצית glucuronide ידי UGTs שלב II אנזימים, עם מראה UGT1A6 ו UGT1A9 הפעילות הגבוהה ביותר.
הבין את חילוף חומרים של xenobiotics הוא קריטי בהערכת בטיחות תרופה ועל הערכת סיכונים כימית משתי סיבות: קינטיקה התגובה תקבע כמה זמן תרופה או כימי תישאר בגוף באופן b טופס פעיל או לא פעילהפרשת efore; יכול להיות משונה במתחם ההורה על מינים, לא יציבים ורעילים תגובתי יותר על ידי אנזימים מטבוליים. תגובות אלו ידועים גם בשם "bioactivation" מונעות בעיקר על ידי שלב I CYP אנזימים אלא גם בהזדמנויות נדירות על ידי נטיית שלב II 5.
בהתבסס על זה, את היכולת של מודל במבחנה לנבא את הסיכון במדויק הקשורים תרופה או חומר כימי תלויה מאוד על מיומנות מטבוליות של מערכת התא. שורות תאים שמקורם לרקמות החולות או טרנספורמציה של תאים נורמליים קרובות מאבדים חלק אם לא את כל נציג פרופיל האנזים המטבולי של רקמת מוצאם 6. התחזוקה של פרופיל האנזים המטבולי הנורמלי נראית טובה יותר בתרביות תאים ראשוניות (לפחות בתרבויות בטווח קצרות), והוא השתפר עוד יותר אם הרקמה היא בתרבית מטריצה שמאפשרת לו לשמור על מבנה 3D שלה 1. לכן, characterization של מיומנות מטבוליות של מערכת תאים במבחנה ב מהווה צעד ראשוני חשוב המנחה את ההחלטה לגבי איזה דגם תא ראוי לערוך הערכות בטיחות כימיות.
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל הפעילות והביטוי של אנזימי CYP שלב I במבחנה עם דוגמאות של היישום שלהם עם שורת תאים בכבד 7 ו תרביות תאי ריאות 3D עיקריות 8. מצעים ספציפיים CYP, המוצרים המטבולית שלהם מעכב השולט מתוארים יחד עם spectrometry- ההמוני ושיטות כימות מבוססות luminogenic. מאחר שחלק CYPs הם מושרה ואחרים אשר מכוננים, דוגמאות גם תינתן לשני תרחישים אלה.
נכון לעכשיו, מערכות בדיקה טוקסיקולוגית סטנדרטיות רבות להשתמש בחיידקים מהונדסים, שורות תאים, או תאים עובריים כי הם אינם מייצגים את חילוף החומרים האנושיים הרגיל 1. זה יכול להוביל תחזיות מדויקות של הפעילות הרעילה הפוטנציאל של חומר כימי או רפואה. חדשני במודלים חוץ גופייה, כגון תרביות תאי 3D ו איבר על שבב, מפותחים בניסיון לשכפל את המורפולוגיה הנורמלית יותר ופעילות מטבולית של רקמות אנושיות 21, 22, 23. מיומנות מטבולית היא קריטריון אחד שיכול לשמש כדי לפענח איזה דגמים מתאימים ביותר ללימודי הערכה טוקסיקולוגית biotransformation סמים.
פרוטוקול גיבשנו במאמר זה נועד למדוד את הפעילות של אנזימים CYP באמצעות תאים חיים. היא גמישה ויכולה לשמש מערכות תאים שונות ב cultur 2D או 3Des ומציעה את האפשרות להשתמש גם probe- luminogenic או בגישה מבוססת ספקטרומטריית מסה. שני השיטות רגישות מספיק כדי לזהות כמויות ננוגרם של חומרים ורק דורש מספר קטן של תאים שגודלו במתכונת multiwell. הם יכולים להיות מיושמים גם אליפטית או תאים שגודלו מטריצות מורכבות. הבחירה של המצע החללי היא ללא ספק אלמנט קריטי של הפרוטוקול. הספציפיות של assay מסתמך על בדיקה להיות סלקטיבי של האנזים CYP ואת שכבה נוספת של ביטחון ניתן להשיג על ידי שימוש במעכבי CYP סלקטיבית. מצעי המעכבים המפורטים במאמר זה הם רק כמה דוגמאות, אבל אחרים ניתן למצוא בספרות.
חשוב לשקול מספר פעמי דגירה כאשר עובד עם סוג תא חדש כתוצאת מפעילות CYP שלילית יכול להיות בגלל האנזים לידי ביטוי ברמה נמוכה. התוספת של סוג תא שיכול לשמש כביקורת חיובית רצויה להבטיח כיתוצאה שלילית אינה קשורה לבעיה טכנית וכדי לעזור עם כל בעיות. תאי כבד ראשיים הם מוסמך מטבולית ויכולים לשמש מלא, עבור hepatocytes העיקרי למשל השעיה קלה מאוד להשתמש אך הכדאיות שלהם מוגבלת בזמן. שורות תאים כבדית הם חלופות אפשריות אשר קל יחסית להשתמש כמתואר בפרוטוקול זה, אך חלקם טובים יותר מאחרים מבחינת פעילות מטבולית 6, 21.
מאז assay אינה הורסת, אלא אם החלבון הכולל מכמתים, אפשר לעקוב אחר פעילות CYP לאורך זמן במחקרי אורך 20. זוהי נקודה חשובה מאחר שחלק מהתאים יהיו פעילות CYP משתנית לאורך זמן בתרבות. תוצאה שלילית עלולה להיות קשורה לחוסר confluency, התקדמות עם בידול או dedifferentiation במבחנה. במקרה כזה, הגישה היא חצי quantitative מאחר שהנתונים לא מנורמלים לפי כמות החלבון הכולל בכל תרבית תאים. זה לא תמיד אפשרי או מומלץ לעשות שימוש חוזר הרקמה לאחר מדידת פעילות CYP כחשיפת בדיקות, מעכבים או מעוררים יכול להיות השפעה רעילה על הרקמה כמו במקרה של TCDD.
שברים ניידים כגון microsomes יכולים לשמש גם כדי לאפיין את פעילות CYP של סוג תא נתון. גוּפִיפוֹן הכנות, לעומת זאת, דורשות הרבה חומר תא, התוספת של קו-פקטורים נאותים חיץ על מנת להבטיח כי האנזימים להישאר פעילים. שימוש בתאים חיים מבטלת את הצעד הכנה גוּפִיפוֹן מסובך ועבודה אילו מאגרים קו-פקטורים פועלים בצורה הטובה ביותר.
כהמלצה כללית, זהו נוהג טוב ביותר להמשיך לאפיין את פרופיל הביטוי של CYPs בתרביות תאים כדי לוודא שהוא תואם את הפעילות האנזימטית. רמת האימות נוספת זה מומלץ בהתחשב בכך בדיקות מטבוליות אינן entiלהסתמך ספציפי CYP אחת וזה נותן אמון מוגבר כי הפעילות המטבולית הנמדדת השתווה ביטוי האנזים המקביל. מאז CYPs הם חלבוני בממברנה הם קשים יחסית להתכונן כתמים מערביים, ולכן כמוני RT-PCR כבר הגישה המועדפת לפרופיל אנזימים אלה 20.
חשוב לציין כי פרוטוקול זה מתאר שיטה פעילות האנזים CYP assay שרק מייצג משפחה אחת אנזימים מטבוליים, אם כי חשוב אחד. הגמישות של גישה ספקטרומטריית מסה מאפשרת הפיתוח של שיטות רכישה עבור טרנספורמציות מטבוליות אחרות של מצעים חלליים. עם זאת, אלה יש לפתח אותם אחד בכל פעם, יש כיום פחות ידוע בדיקות ספציפיות ומעכבי סלקטיבית למשפחות אנזים מטבוליות אחרות. צריך להתייחס זה פער כדי לאפשר הערכה מקיפה של מיומנות מטבוליות של syste תא במבחנה בגברת.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |