Compétence métabolique des systèmes in vitro est une condition essentielle pour la biotransformation et l' élimination des médicaments et produits toxiques. Dans ce protocole, nous décrivons l'application des sondes métaboliques de référence pour évaluer métabolisme de phase I dans les cultures cellulaires.
enzymes métabolisant des xénobiotiques jouent un rôle clé dans la biotransformation de médicaments et de substances toxiques en ajoutant des groupes fonctionnels qui augmentent la solubilité et faciliter l'excrétion. À certaines occasions, ces modifications structurelles conduisent à la formation de nouveaux produits toxiques. Afin de réduire les tests sur les animaux, le risque chimique peut être évaluée en utilisant des cellules métaboliquement compétentes. L'expression des enzymes métaboliques, cependant, ne sont pas stables dans le temps dans de nombreux systèmes in vitro de culture primaire et est souvent partielle ou absente dans des lignées cellulaires. Par conséquent, l'étude des médicaments, des additifs et le métabolisme des polluants de l' environnement in vitro devrait idéalement être réalisée dans des systèmes cellulaires où l' activité métabolique a été caractérisée. Nous expliquons ici une approche pour mesurer l'activité d'une classe d'enzymes métaboliques (phase I humaine) dans des lignées cellulaires 2D et 3D cultures primaires utilisant des sondes chimiques et leurs produits métaboliques quantifiables par spectrométrie de masse et UPLCluminométrie. Le procédé peut être mis en oeuvre pour tester l'activité métabolique dans des lignées cellulaires et des cellules primaires dérivées d'une variété de tissus.
Le métabolisme des xénobiotiques est le processus par lequel des produits chimiques étrangers au corps sont modifiés par l'ajout de groupes hydrophiles et conjugués pour faciliter leur excrétion 1. Typiquement , le métabolisme des xénobiotiques est un processus en deux étapes avec la première phase composée principalement d'une oxydation avec l'addition d'un ou plusieurs groupes hydroxyle, 1 2. Lors de la phase II, les groupes hydroxyle sont utilisés comme accepteurs pour un conjugué hydrophile tel que le glucuronide ou un groupement sulfate 1, 2. Si un groupe accepteur est déjà présent sur les molécules, l'étape de conjugaison peut se produire indépendamment du métabolisme de la phase I. Chaque réaction est réalisée par un groupe d'enzymes spécifiques, par exemple, CYP (cytochromes P450), qui catalysent l'hydroxylation (Figure 1) et la désalkylation de substrats chimiques 3. Conjugation est catalysée par des sulfotransférases, UDP-glucuronosyltransferases (figure 1), la glutathion-S-transférases et les N-acétyltransférases 4. Chaque tissu et organe auront un profil d'expression de l'enzyme métabolique spécifique, avec le foie exprimant la plupart de ces protéines.
Figure 1: Exemple de phase I et de métabolisme de la coumarine Phase II. CYP2A6 / CYP2A13 catalyser la 7-hydroxylation de la coumarine. 7-hydroxycoumarine est conjugué à un fragment glucuronide par des enzymes de phase II UGT, avec UGT1A6 et UGT1A9 montrant la plus forte activité.
Comprendre le métabolisme des xénobiotiques est essentiel dans l'évaluation de l'innocuité des médicaments et pour l'évaluation des risques chimiques pour deux raisons: la cinétique de réaction détermineront combien de temps un médicament ou chimique restent dans le corps sous une forme active ou inactive bexcrétion vant; et le composé d'origine peut être modifié pour une espèce plus réactive, instable et toxique par des enzymes métaboliques. De telles réactions aussi connu sous le nom « bioactivation » sont principalement motivés par la phase I CYP enzymes mais aussi plus rarement par la conjugaison de phase II 5.
Sur cette base, la capacité d'un modèle in vitro pour prédire avec précision le risque associé à un médicament ou d' un produit chimique est très dépendante de la compétence métabolique du système cellulaire. Les lignées cellulaires dérivées de tissus malades ou de la transformation de cellules normales perdent souvent partie sinon la totalité du représentant de profil d'enzyme métabolique de leur tissu d'origine 6. Le maintien du profil d'enzyme métabolique normal apparaît mieux dans les cultures de cellules primaires (au moins dans des cultures à court terme) et est encore améliorée si le tissu est mis en culture dans une matrice qui lui permet de conserver sa structure 3D 1. Par conséquent, l'omble chevalieracterization de la compétence d'un système métabolique cellulaire in vitro est une étape préliminaire importante pour guider la décision en ce qui concerne le modèle de la cellule est appropriée pour effectuer des évaluations de sécurité chimique.
Dans cet article , nous présentons un protocole de profil de l'activité et de l' expression des enzymes de phase I CYP in vitro avec des exemples de leur application avec une lignée de cellules hépatiques et 7 des cultures de cellules pulmonaires primaires 3D 8. CYP substrats spécifiques, leurs produits métaboliques et l'inhibiteur de contrôle sont décrits avec spectrometry- de masse et des méthodes de quantification sur la base luminogène. Étant donné que certains CYP sont inductibles et d'autres sont constitutives, des exemples seront également donnés pour ces deux scénarios.
À l' heure actuelle, de nombreux systèmes de test toxicologiques standardisés utilisent des bactéries Engineered, des lignées cellulaires ou des cellules embryonnaires qui ne sont pas représentatives du métabolisme humain normal 1. Cela peut conduire à des prévisions inexactes de l'activité potentielle toxique d'un produit chimique ou de la médecine. Innovante dans les modèles in vitro, tels que des cultures de cellules 3D et organes sur une puce, sont en cours d' élaboration dans le but de mieux reproduire la morphologie normale et l' activité métabolique des tissus humains 21, 22, 23. compétence métabolique est un critère qui peut être utilisé pour déchiffrer les modèles sont mieux adaptés pour une évaluation toxicologique et des études biotransformation des médicaments.
Le protocole que nous avons décrit dans le présent document est conçu pour mesurer l'activité des enzymes CYP en utilisant des cellules vivantes. Il est flexible et peut être utilisé pour les systèmes cellulaires différents cultur 2D ou 3Des et offre la possibilité d'utiliser un Probe- ou luminogène une approche basée sur la spectrométrie de masse. Les deux méthodes sont assez sensibles pour détecter des quantités de nanogrammes de matériaux et ne nécessitent qu'un petit nombre de cellules cultivées dans un format multipuits. Ils peuvent également être appliqués à sphéroïde ou des cellules cultivées dans des matrices complexes. Le choix du substrat de sonde est évidemment un élément critique du protocole. La spécificité du dosage repose sur la sonde étant sélective de l'enzyme CYP et une autre couche d'assurance peut être obtenue par l'utilisation d'un inhibiteur de CYP sélective. Les substrats et inhibiteurs mentionnés dans le présent document ne sont que quelques exemples, mais d'autres se trouvent dans la littérature.
Il est important de considérer plusieurs temps d'incubation lorsque vous travaillez avec un nouveau type de cellule à la suite de l'activité de CYP négative pourrait être due à l'enzyme exprimée à un faible niveau. L'ajout d'un type cellulaire qui peut être utilisé comme témoin positif est conseillé de veiller à ce qu'unrésultat négatif est pas lié à un problème technique et d'aider avec des procédures de dépannage. cellules hépatiques primaires sont métaboliquement compétentes et peuvent être utilisés comme contrôle, par exemple les hépatocytes primaires en suspension sont très faciles à utiliser, mais leur viabilité est limitée dans le temps. Des lignées de cellules hépatiques sont des alternatives possibles qui sont relativement faciles à utiliser comme décrit dans ce protocole, mais certains sont mieux que d' autres en termes d'activité métabolique 6, 21.
Étant donné que le test est non destructive, à moins que la protéine totale est quantifiée, il est possible de suivre l'activité de CYP au fil du temps dans les études longitudinales 20. Ceci est un point important parce que certaines cellules auront variables activité CYP au fil du temps dans la culture. Un résultat négatif peut être associé à l'absence de confluence, des progrès avec la différenciation ou dédifférenciation in vitro. Dans ce cas, l'approche est semi-quantitative puisque les données ne sont pas normalisée par la quantité totale de protéine dans chaque culture cellulaire. Il est pas toujours possible ou recommandé de réutiliser le tissu après avoir mesuré l'activité de CYP que l'exposition à des sondes, des inhibiteurs ou inducteurs peuvent avoir un effet toxique sur le tissu comme est le cas pour la TCDD.
Les fractions cellulaires tels que les microsomes pourraient également être utilisées pour caractériser l'activité de CYP d'un type cellulaire donné. Microsomes préparatifs, cependant, nécessitent beaucoup de matériel cellulaire, l'ajout de cofacteurs adéquates et un tampon pour assurer que les enzymes restent actives. L'utilisation de cellules vivantes élimine l'étape délicate de préparation de microsomes et de travail qui tamponne et cofacteurs fonctionnent le mieux.
Comme recommandation générale, il est recommandé de caractériser le profil d'expression de CYP dans des cultures de cellules pour vérifier qu'il correspond à l'activité enzymatique. Ce niveau supplémentaire de vérification est recommandée étant donné que les sondes métaboliques ne sont pas Enticompter spécifique à un seul CYP et lui donne une confiance accrue que l'activité métabolique mesurée est compensée par l'expression de l'enzyme correspondante. Depuis CYP sont des protéines membranaires , ils sont relativement difficiles à préparer western blots, donc a été l'approche privilégiée RT-PCR quantitative au profil de ces enzymes 20.
Il est important de noter que ce protocole décrit une méthode pour tester l'activité enzymatique CYP qui ne représente qu'une famille d'enzymes métaboliques, certes importante. La flexibilité d'une approche par spectrométrie de masse permet le développement de méthodes d'acquisition pour d'autres transformations métaboliques de substrats de sonde. Cependant, celles-ci doivent être mis au point un à la fois et il y a actuellement moins de sondes spécifiques connues et des inhibiteurs sélectifs pour d'autres familles d'enzymes métaboliques. Cet écart doit être adressée à permettre une évaluation complète de la compétence métabolique in vitro systè cellulaireMme.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |