Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.
Bronkoalveolar Lavaj (BAL), devam etmekte olan bir hastalık halini anlamaya yönelik olarak ex vivo olarak akciğer lümeninin hücresel ve hücresel içeriğini incelemek için kullanılan deneysel bir prosedürdür.
Burada, özel alet veya ekipmana ihtiyaç duymadan, fare atıkları üzerinde BAL'yi gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yöntem tarif edilmiştir. BAL sıvısı, terminal anestezi uygulanmış farelerin trakeasına bir kateteri sokarak izole edilir; buradan bronşiollere bir tuz çözeltisi damlatılır. BAL sıvı alımını en üst düzeye çıkarmak ve kesme kuvvetlerini en aza indirgemek için, damlatılmış sıvı hafifçe çekilir. Bu teknik havayollarında ve BAL sıvısındaki hücrelerin canlılığı, fonksiyonu ve yapısının korunmasını sağlar.
Akciğer hastalık durumunun daha iyi anlaşılması için birçok teknik uygulanabilir. Burada, farklı türlerde bağışıklık hücrelerinin tanımlanması ve numaralandırılması için yaygın olarak kullanılan bir tekniktarif edilen, burada sitometrisi floresan etiketli hücre yüzeyi özgü işaretlerin seçilmiş bir panel ile birleştirilir akış. Burada sunulan BAL prosedür de murin akciğerlerde enfeksiyon maddeleri, sıvı bileşenleri ya da nefesle çekilmiş olan parçacıklann analiz etmek için kullanılabilir.
Hava yolları, inflamasyon, patojen istilası veya habis transformasyona yol açabilen çok sayıda hakaretle karşılaşır. Akciğer lümenini hizalayan epitel hücreleri, memeli vücudunun başlıca engellerinden birini oluşturur. Alveolar makrofajlarla birlikte, çevresel tehditlerin solunum yolu yoluyla sistemik sisteme girmesini önler. Bu tür tehditlere örnek olarak organik ve inorganik kimyasallar, bakteri ve virüsler verilebilir. Aynı şekilde, spesifik aşılar veya terapötik müdahaleler akciğerleri hedef alacak şekilde tasarlanabilir. Bütün bu örneklerde, uyarılmış yanıtın detaylı bir analizi, solunum sistemi içerisinde gerçekleşen biyolojik süreçleri anlamak, müdahale etmek veya önlemek için önemlidir.
Bronkoalveoler lavaj (BAL), bu tür yanıtları analiz etmek için paha biçilemez bir yöntemdir; sonuçtaki örnekler, inflamatuar yanıtlar, bağışıklık mekanizmaları ve bulaşıcı hastalık progresyonu hakkında önemli bilgiler içermektedirpulmoner solunum yolları 1, 2 oluşabilir. BAL kullanılarak, infiltre hücrelerini inceleme mümkündür. Bu, pek çok ölü ve yapışkan hücreler ile, bir "kirli" hücre popülasyonu vermek sindirilmiş akciğerler, ters düşmektedir. BAL terminal bronşiyollere bir tuz çözeltisi verilmesi ve daha sonra bu çözeltinin geri kazanılması ile gerçekleştirilir. alınan çözelti daha sonra ölçmek ve fenotipik yerleşik akciğer ve infiltratif inflamatuar hücrelerin analiz etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, genellikle, örneğin astım gibi solunum yolu hastalık modelleri, hücresel akını çalışma uygulanır, Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığı (KOAH) ve enfeksiyon hastalık modelleri. Yanı sıra hücre bileşiminden, akciğer solunum yolları moleküler bileşim ayrıca BAL sıvısında yansıtılır. Bu analiz için, enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA), immünoblot ve sitokin kordon dizisi tarafından çok sayıda sitokin aynı anda analiz edilebilirSitokinler ve kemokinler varlığının değerlendirilmesi için yapıldı.
BAL inflamatuar solunum yolu hastalığı hayvan modellerinde inflamatuvar hücrelerin akını incelemek için iyi bilinen bir yöntemdir. Değişik bir hücresel akının gözlenmesi ( örneğin artmış lenfosit, eozinofiller veya nötrofiller düzeyleri), hastalığa daha iyi kavrayışlara yol açabilir ve terapötik müdahalenin performansını değerlendirmek için objektif bir parametre olabilir.
BAL hücresel analizinin doğru ve tekrarlanabilir yorumu, BAL'nin doğru bir şekilde uygulanmasını ve toplanan sıvının düzgün bir şekilde işlenip işlenmesini gerektirir. "Bronş lavajı" terimi seksen yıl önce Stitt 3 tarafından tanıtıldı. 1961'de Myrvik, tavşan akciğerlerinin lavaj sıvısından alveolar makrofajlar elde etti. BAL, şimdi fare modelinde akciğerleri analiz etmek ve izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmasına rağmenbilimsel literatürde 4, 5 de standardize BAL prosedürünün hiçbir rapor hala tekrar gönderilebilir. Ayrıca, muhtemelen tekniği 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 kullanılarak araştırma laboratuarları olarak orada BAL gerçekleştirmek için pek çok yol vardır. BAL elde edilen veriler tüm fare akciğer temsil eder ve akciğerin sadece bir parçası olması önemlidir. değişkenlik Bu tür yorumlanması ve farklı denemeler arasındaki sonuçların karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır.
Burada, temel, ucuz ve yeniden üretilebilir bir BAL prosedürü fare hava yolu lümeninde var olan hücre ve çözünebilir fraksiyon toplama sağlayan tarif edilmektedir. Kısaca, bir kateter maruz trakea o altindaFa terminally anestezi fare. Katetere bir şırınga bağlanır ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tamponlu salin solüsyonu akciğerlere verilir. Akciğer lümeni, dalgıç çözeltinin dalgıç kullanılarak tekrar tekrar akıtılması ile örneklenir. Bu adım esnasında uygulanan negatif basınç, hava yolu çöküşünü önlemek için minimaldir. Toplama işlemini takiben, elde edilen BAL, akış sitometrisi ile hücrelerin numaralandırılması ve tanımlanması için daha da işlenmelidir.
BAL, enfeksiyonlara veya ilaçlara yanıt olarak sitolojik ve biyokimyasal bilgi elde etmek için yararlı bir tekniktir. Başlangıçta, BAL, fosgen toksisitesi 3 olan insan hastalarda aşırı mukus üretimini yönetmek için kullanıldı. Günümüzde bu teknik, insanlarda 3 , 24 hastalıkların akciğer patogenezi, tanı ve terapötik yönetimini araştırmak için kullanılmaktadır. Laboratuvar hayvanlarında, BAL, inflamatuar cevapları, bağışıklık mekanizmalarını ve pulmoner hava yolları 1 , 2'de ortaya çıkan bulaşıcı hastalık süreçlerini izlemek için sıklıkla kullanılır.
Solunum yolu hastalığı modellerinde inflamatuvar hücresel paternin çalışılması için BAL mutlak ve diferansiyel hücre sayımı ile izlenmelidir. Mutlak hücre numarasına ek olarak, ilgili hücre sayıları da ilgilidir. Örneğin, onarım ve kanser modelleri vBAL hücre sayımı artar veya azalmaz. Bu modelde, hücresel kompozisyonun değerlendirilmesi faydalıdır. Işık mikroskopisi ile kombine edilmiş hücre boyaması kullanarak, eozinofiller, nötrofiller, makrofajlar ve limfositler gibi farklı hücre tipleri, morfoloji 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30'a dayalı olarak tanımlanabilir. Akış sitometrisi, farklı T-hücresi fenotiplerini 7 , 31 belirlemek gibi spesifik değerlendirmeler için kullanılabilir. Farklı infiltre hücre popülasyonlarının tanımlanmasına ek olarak, akciğerin hücresel olmayan kompozisyonu BAL kullanılarak araştırılabilir. BAL sıvısında sitokinler, büyümeyi belirlemek için ELISA, immünoblot, sitokin boncuk dizilimi, immünohistokimya ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gibi yöntemler uygulanırFaktörler ve diğer enflamatuar bileşenler. Akciğer hasarını belirlemek için BAL sıvısındaki toplam protein ve laktat dehidrogenaz seviyeleri 32,33 olarak ölçülebilir.
Yeni teşhis aletlerinin geliştirilmesi ile yakın gelecekte BAL bileşenlerinin genomik ve proteomik karakterizasyonu mümkün olacaktır. Hesaplama yeteneklerini ve yüksek verimli gen ekspresyon teknolojilerini genişleten kombinasyon, çeşitli hastalık durumları için spesifik gen ifade profillerini tanımlamayı mümkün kılacaktır. Bu teknikleri BAL sıvısı üzerinde gerçekleştirmek, akciğer hastalıklarının farklı evrelerinde yer alan önemli molekülleri tanımlamak için gen ve protein ifade kalıpları sağlayabilir.
BAL akışkanından elde edilen verilerin temel sınırlaması, farklı araştırma çalışmaları 3 , 9 arasında karşılaştırılabilirlik eksikliğidir. Yüksek derecedeLavaj tekniği değişkenliği ve BAL sıvısının sonraki işlem. Her BAL deneme karşılaştırmak mümkün olması için, damlatılır lavaj sıvısının türü, instilasyon sitesi ve hücresel ve hücresel olmayan bileşim için analiz edilecek olan bir kısmını standardize etmek için gereklidir. Bir 14 kez 34, 35, 36 arasında değişen farklı denemeler arasında lavaj kısımların sayısı önemli farklılıklar vardır. Bu fark akciğerlerde tahmini toplam hücre sayıları üzerinde etkisi olabilir. BAL sıvısı kesir hücrelerinin çoğunluğu içeren bilmek önemlidir. Song ve ark. toplam hücre sayısının yaklaşık% 70, üç ila 22 fraksiyon bir de elde edildi göstermiştir. Ancak, diğer raporlar ikinci lavaj, 38 ilkinden 37 daha fazla hücre içerdiğini öne </sup>. Bu çalışmalardan sadece bir fraksiyonlu bir lavajın tüm akciğeri temsil etmediğini ve sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtığını söyleyebiliriz.
BAL sıvısının hücre dışı kompozisyonu akciğer 33 , 39 , 40'ın sağlık durumu hakkında değerli bilgiler içerir. BAL sıvısının seyreltilmesindeki değişiklikler, çözünür fraksiyonun miktarının belirlenmesindeki farklılığa ve dolayısıyla denemeler arasındaki sonuçların farklılığına katkıda bulunur. Song ve ark. Her lavaj fraksiyonunun protein ve laktat dehidrojenaz seviyelerini karşılaştırdı ve birinci lavaj fraksiyonunun ikinci fraksiyonun iki ila üç katı fazla olduğu sonucuna vardı.
Analiz için temsilci BAL örneğini almak için bazı teknik hususlar çok önemlidir. Bunlardan biri doğru anestezi uygulamaktır. Ayak refini kontrol etmek çok önemlidir.Terminal sedasyon sağlamak için fare lex. Bu yalnızca etik nedenlerden ötürü değil, aynı zamanda, fare düzgün anestezi altına alındıysa kateterin doğru konuma getirilmesi ve tutulmasının zor olması nedeniyle de önemlidir.
İkinci önemli teknik husus, kateterin trakeadaki pozisyonudur. Kateter çok derin yerleştirildiğinde, akciğer yapısına zarar verebilir. Kateterin distal ucu BAL işlemi sırasında akciğerlere ulaşmamalıdır. Kateter aynı zamanda stabilize edilmeli ve pamuklu bir ip ile bağlanmalıdır. Kateter stabilize edilmemişse, enjekte edilen tuz çözeltisi akciğerlere değil, burun boşluğuna yukarı akabilir. Salin solüsyonunun enjeksiyonu ve aspirasyonu sırasında, kateteri sabit tutmak önemlidir.
BAL sıvısından elde edilen veriler, fare atesindeki tüm akciğerini temsil etmelidir. Bu nedenle, yeterli bir hacimde tuz tamponu ( örn.1 mL her biri) 3 alikoya bölünmüş 3 mL,. hücre verimi ve BAL sıvısı verimi arasında doğrusal bir ilişki vardır. Fare göğüs kafesi masaj yaparken hafifçe çözüm toplamak için önemlidir. kesme kuvvetleri çok güçlü ise, solunum yolları ve BAL sıvısında hücrelerin canlılığı, fonksiyon ve yapı çalınmış olabilir. Aspire edilen sıvı şırınga içinde görünmüyorsa, dikkatlice kateter derin veya daha yüksek trakea hareket eder.
Özel uyarı BAL işleme ve analiz belirli yönleriyle verilmelidir. Bu BAL örneklerinden tutulan bilgiyi maksimize edecek. BAL sonra, hücreler, bir besleyici-zayıf bir tuz ortamında bulunmaktadır. BAL örnekleme sonra 1 saat içinde örnekleri işlemek için bu nedenle çok önemlidir. uzun süreli depolama gerekli ise, bir besin takviye ortamın kullanılması gerekmektedir.
hücre canlılığını korumak için, yüzeye hücre yapışmasını teşvik tüpleri kaçının. ce kaçınınHücre süspansiyonlarının hücre bütünlüğünü tehlikeye atacak veya alınan BAL hücrelerinin üniform tekrar süspansiyonunu önleyecek hızda n-santrifüjlenmesi. BAL sıvısı içeren hücreler 7 dakika boyunca 400 xg ve 4 ° C'de santrifüje tabi tutulmalıdır. İşlem sırasında hücre süspansiyonlarının 4 ° C'de tutulması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.
The authors have nothing to disclose.
SVH Ghent Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Moleküler Biyoloji bir araştırma yardımcısıdır. ERJ UniVacFlu tarafından desteklenen, hibe numarası 607690. KR EC-FP7 proje FLUNIVAC tarafından desteklenmektedir.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |