Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias
Özet
O estado de saúde do pulmão é refletido pelo tipo e número de células imunes que estão presentes nos bronquíolos do pulmão. Descrevemos uma técnica de lavagem broncoalveolar que permite o isolamento e estudo de células não aderentes e fatores solúveis do trato respiratório inferior de camundongos.
Abstract
Lavagem Broncoalveolar (BAL) é um procedimento experimental que é usada para examinar o conteúdo celular e acelular do lúmen dos pulmões ex vivo para ter uma visão do estado de doença em curso.
Aqui, um método simples e eficiente é descrito para executar BAL em pulmões de murino sem a necessidade de ferramentas ou equipamentos especiais. fluido BAL é isolado por meio de inserção de um cateter na traqueia de ratos anestesiados terminalmente, por meio do qual uma solução salina é instilada nos bronquíolos. O fluido instilado é suavemente retraído para maximizar a recuperação de fluido BAL e para minimizar as forças de cisalhamento. Esta técnica permite a viabilidade, a função e estrutura de células dentro das vias aéreas e LBA a ser preservada.
Inúmeras técnicas podem ser aplicadas a ganhar mais compreensão do estado de doença do pulmão. Aqui, uma técnica vulgarmente utilizada para a identificação e contagem de diferentes tipos de células imunitárias éDescrito, em que a citometria de fluxo é combinada com um painel seleccionado de marcadores marcados fluorescentemente com uma superfície celular específica. O procedimento BAL aqui apresentado também pode ser utilizado para analisar agentes infecciosos, constituintes fluidos ou partículas inaladas dentro de pulmões murinos.
Introduction
As vias aéreas encontram inúmeros insultos, que podem levar a inflamação, invasão de patógenos ou transformação maligna. As células epiteliais que revestem o lúmen pulmonar formam uma das principais barreiras do corpo de mamíferos. Juntamente com os macrófagos alveolares, eles impedem que as ameaças ambientais ganhem entrada no sistema sistêmico através das vias aéreas. Exemplos de tais ameaças incluem produtos químicos orgânicos e inorgânicos, bactérias e vírus. Do mesmo modo, imunizações específicas ou intervenções terapêuticas podem ser concebidas para atingir os pulmões. Em todos estes casos, uma análise elaborada da resposta evocada é importante para compreender, intervir ou evitar processos biológicos que ocorrem dentro do sistema respiratório.
O lavado broncoalveolar (BAL) é um método inestimável para analisar tais respostas, pois as amostras resultantes contêm informações importantes sobre as respostas inflamatórias, mecanismos imunológicos e progressão da doença infecciosaque podem ocorrer nas vias aéreas pulmonares 1, 2. Usando BAL, é possível estudar as células infiltrantes. Isto contrasta com os pulmões digerida, que dão uma população de células "mais sujo", com muitas células mortas e pegajosas. BAL é realizada através da introdução de uma solução salina nos bronquíolos terminais e, posteriormente, recuperar esta solução. A solução obtida pode em seguida ser utilizada para quantificar e fenotipicamente analisar pulmão residentes e células inflamatórias infiltrantes. Este método é frequentemente aplicado para estudar influxo celular em modelos de doenças das vias respiratórias, tais como asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), e modelos de doenças infecciosas. Para além da composição celular, a composição molecular das vias aéreas pulmonares reflecte-se também no fluido BAL. Para analisar esta,-ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunotransferência, e a análise simultânea de múltiplos citocinas por uma variedade de citoquinas pode ser grânuloRealizado para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas.
O BAL é um método bem estabelecido para estudar o influxo de células inflamatórias em modelos animais de doenças respiratórias inflamatórias. A observação de um influxo celular alterado ( por exemplo, níveis aumentados de linfócitos, eosinófilos ou neutrófilos) pode levar a uma melhor compreensão da doença e pode ser um parâmetro objetivo para avaliar o desempenho de uma intervenção terapêutica.
A interpretação precisa e reprodutível da análise celular BAL requer que o BAL seja realizado correctamente e que o fluido recolhido seja manuseado e processado adequadamente. O termo "lavagem brônquica" foi introduzido há mais de oitenta anos por Stitt 3 . Em 1961, Myrvik obteve macrófagos alveolares do fluido de lavagem de pulmões de coelho 3 . BAL é agora um método comumente usado para analisar e monitorar os pulmões no modelo de rato,Ainda não há relato de um procedimento BAL padronizado na literatura científica 4 , 5 . Além disso, há provavelmente tantas maneiras de executar BAL quanto há laboratórios de pesquisa usando a técnica 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . É importante que os dados obtidos a partir do BAL representem todo o pulmão murino e não apenas uma parte do pulmão. Este tipo de variabilidade complica a interpretação e comparação de resultados entre os diferentes ensaios.
Aqui, descreve-se um procedimento BAL básico, barato e reprodutível que permite a recolha da fracção celular e solúvel presente no lúmen das vias respiratórias do rato. Em resumo, um cateter é colocado na traquéia expostafa rato terminal anestesiado. Uma seringa é ligado ao cateter, e uma solução salina tamponada contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é introduzido nos pulmões. O lúmen dos pulmões é amostrado por lavagem repetida suave da solução salina utilizando o êmbolo. A pressão negativa aplicada durante este passo é mínimo para impedir o colapso das vias aéreas. Após a colheita, a BAL obtido deve ser processado ainda mais para enumerar e identificar as células por citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
BAL é uma técnica útil para obter informações citológicas e bioquímicas em resposta a infecções ou drogas. Inicialmente, o BAL foi utilizado para gerenciar a produção excessiva de muco em pacientes humanos que sofrem de toxicidade por fosgênio 3 . Atualmente, a técnica é utilizada em humanos para investigar patogênese pulmonar, diagnóstico e manejo terapêutico de doenças 3 , 24 . Em animais de laboratório, o BAL é comumente usado para monitorar respostas inflamatórias, mecanismos imunológicos e processos de doenças infecciosas que ocorrem nas vias aéreas pulmonares 1 , 2 .
Para estudar o padrão celular inflamatório em modelos de doença respiratória, o BAL deve ser seguido pela contagem de células absoluta e diferencial. Além do número absoluto de células, os números de células relativos são também de interesse. Por exemplo, modelos de reparo e câncer mostram very pequeno para não BAL contagem de células aumenta. Neste modelo, a avaliação da composição celular é útil. Usando coloração de células combinada com microscopia de luz, diferentes tipos de células, tais como eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos, podem ser identificadas com base na morfologia 25, 26, 27, 28, 29, 30. A citometria de fluxo pode ser usado para as avaliações específicas, tal como para identificar diferentes fenótipos de células T 7, 31. Para além da identificação das diferentes populações de células de infiltração, a composição não-celular do pulmão pode ser investigado utilizando BAL. Métodos tais como ELISA, imunotransferência, matriz citocina grânulo, imuno-histoquímica, e reacção em cadeia da polimerase quantitativa são realizadas no fluido de BAL a determinar citocinas, crescimentoFatores inflamatórios e outros componentes inflamatórios. Para determinar o dano pulmonar, os níveis de proteína total e lactato desidrogenase no fluido BAL também podem ser medidos 32 , 33 .
Com o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico, a caracterização genômica e proteômica de componentes BAL será possível no futuro próximo. A combinação de capacidades computacionais em expansão e tecnologias de expressão génica de alto rendimento tornará possível definir perfis de expressão de genes específicos para vários estados de doença. A realização destas técnicas em fluidos BAL pode fornecer padrões de expressão de genes e proteínas para identificar as moléculas importantes envolvidas nas diferentes fases das doenças pulmonares.
A principal limitação dos dados obtidos a partir do fluido BAL é a falta de comparabilidade entre os diferentes ensaios de pesquisa 3 , 9 . Existe um elevado grau deVariabilidade na técnica de lavagem eo processamento subsequente do fluido BAL. Para poder comparar cada ensaio BAL, é necessário padronizar o tipo de fluido de lavagem que é instilado, o local de instilação ea fração que deve ser analisada quanto à composição celular e não celular. Existem diferenças significativas no número de fracções de lavagem entre diferentes ensaios, variando de um a 14 vezes 34 , 35 , 36 . Esta diferença pode ter um impacto no número total estimado de células nos pulmões. É importante saber qual a fração de fluido BAL contém a maioria das células. Song et ai. Mostraram que aproximadamente 70% do número total de células foram recuperadas na fração um a três 22 . No entanto, outros relatórios sugeriram que a segunda lavagem continha mais células do que a primeira 37 , 38 </sup>. Podemos concluir a partir desses estudos que uma lavagem com apenas uma fração não representa todo o pulmão, levando a má interpretação dos resultados.
A composição não-celular do fluido BAL contém informações valiosas sobre o estado de saúde do pulmão 33 , 39 , 40 . Variações na diluição do fluido BAL contribuem para a diferença na quantificação da fração solúvel e, conseqüentemente, para as diferenças nos resultados entre os ensaios. Song et ai. Comparou os níveis de proteína e lactato desidrogenase de cada fracção de lavagem e concluiu que a primeira fracção de lavagem continha duas a três vezes mais do que a segunda fracção.
Para obter uma amostra BAL representativa para análise, algumas considerações técnicas são cruciais. Um deles é realizar anestesia adequada. É muito importante verificar a referência do péLex do rato para assegurar sedação terminal. Isto não é apenas importante por razões éticas, mas também porque é difícil colocar e reter o cateter na posição correcta se o rato não for adequadamente anestesiado.
Uma segunda consideração técnica importante é a posição do cateter na traquéia. Quando o cateter é inserido muito profundo, pode danificar a estrutura pulmonar. A extremidade distal do cateter não deve atingir os pulmões durante o procedimento BAL. O cateter também deve ser estabilizado e amarrado com um fio de algodão. Se o cateter não está estabilizado, a solução salina injetada pode fluir para cima na cavidade nasal em vez de para dentro dos pulmões. Durante a injecção ea aspiração da solução salina, é importante manter o cateter estável.
Os dados obtidos a partir do fluido BAL devem representar o pulmão murino inteiro. Portanto, é importante incutir um volume adequado de tampão salino ( ie3 mL, dividido em 3 aluotas de 1 mL de cada vez). Não existe uma relação linear entre o rendimento de células e o rendimento de fluido BAL. É importante recolher a solução suavemente enquanto massageia o tórax do mouse. Se as forças de cisalhamento são demasiado forte, a viabilidade, a função e estrutura de células dentro do fluido das vias aéreas e LBA pode ser comprometida. Se o fluido aspirado não é visível na seringa, cuidadosamente mover o cateter mais profunda ou superior na traqueia.
atenção especial deve ser dada aos aspectos específicos de processamento e análise BAL. Isto vai maximizar a informação retida a partir de amostras de BAL. Depois de BAL, as células estão em um meio salino pobre em nutrientes. É, portanto, muito importante para processar as amostras dentro de 1 h após a amostragem BAL. Se o armazenamento prolongado é necessário, é necessária a utilização de um meio suplementado com nutrientes.
Para preservar a viabilidade das células, os tubos evitar que promovem a aderência das células à superfície. Evite ceNtrifugação de suspensões de células a velocidades que são susceptíveis de comprometer a integridade celular ou para evitar uma ressuspensão uniforme das células BAL recuperadas. As células que contêm fluido BAL devem ser centrifugadas a 400 xg e 4 ° C durante 7 min. É importante ter em mente que as suspensões celulares devem ser mantidas a 4 ° C durante o processamento.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HVE é um assistente de pesquisa no Departamento de biomédica Biologia Molecular da Universidade de Ghent. ERJ é suportado por UniVacFlu, número de concessão 607690. KR é suportado pela CE-FP7 FLUNIVAC projeto.
Materials
| balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
| 26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| 1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
| live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
Referanslar
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