L'état de santé du poumon se reflète dans le type et le nombre de cellules immunitaires présentes dans les bronchioles du poumon. Nous décrivons une technique de lavage broncho-alvéolaire qui permet l'isolement et l'étude de cellules non adhérentes et des facteurs solubles des voies respiratoires inférieures des souris.
Lavage broncho – alvéolaire (BAL) est une procédure expérimentale qui est utilisée pour examiner le contenu cellulaire et acellulaire de la lumière du poumon ex vivo afin de mieux comprendre l'état de la maladie en cours.
Ici, une méthode simple et efficace est décrit pour effectuer BAL sur les poumons de souris sans avoir besoin d'outils spéciaux ou de l'équipement. fluide BAL est isolé par insertion d'un cathéter dans la trachée des souris anesthésiées terminale, à travers lequel une solution saline est instillée dans les bronchioles. Le fluide est insufflé doucement rétracté pour maximiser la récupération du liquide BAL et de minimiser les forces de cisaillement. Cette technique permet la viabilité, la fonction et la structure des cellules dans les voies respiratoires et le fluide BAL à conserver.
De nombreuses techniques peuvent être appliquées afin de mieux comprendre l'état de la maladie du poumon. Ici, une technique couramment utilisée pour l'identification et l'énumération des différents types de cellules immunitaires estDécrit, où la cytométrie de flux est combinée avec un panel sélectionné de marqueurs spécifiques de surface cellulaire marquée par fluorescence. La procédure BAL présentée ici peut également être utilisée pour analyser des agents infectieux, des constituants fluides ou des particules inhalées dans les poumons murins.
Les voies respiratoires rencontrent de nombreuses insultes, ce qui peut entraîner une inflammation, une invasion de pathogènes ou une transformation maligne. Les cellules épithéliales qui bordent la lumière pulmonaire constituent l'une des principales barrières du corps mammalien. Avec les macrophages alvéolaires, ils empêchent les menaces environnementales d'entrer dans le système systémique via les voies respiratoires. Des exemples de ces menaces incluent des produits chimiques organiques et inorganiques, des bactéries et des virus. De même, des immunisations spécifiques ou des interventions thérapeutiques peuvent être conçues pour cibler les poumons. Dans tous ces cas, une analyse élaborée de la réponse évoquée est importante pour comprendre, intervenir ou prévenir les processus biologiques qui se déroulent dans le système respiratoire.
Le lavage bronchoalvéolaire (BAL) est une méthode précieuse pour analyser ces réponses, car les échantillons résultants contiennent des informations importantes sur les réponses inflammatoires, les mécanismes immunitaires et la progression de la maladie infectieuseCela peut se produire dans les voies aériennes pulmonaires 1 , 2 . En utilisant BAL, il est possible d'étudier les cellules infiltrantes. Cela contraste avec les poumons digérés, qui donnent une population cellulaire "plus sale", avec de nombreuses cellules mortes et collantes. Le BAL est réalisé en introduisant une solution saline dans les bronchioles terminales et en récupérant ensuite cette solution. La solution récupérée peut ensuite être utilisée pour quantifier et analyser phénotypiquement les cellules inflammatoires pulmonaires et infiltrantes résidentes. Cette méthode est fréquemment appliquée pour étudier l'afflux cellulaire dans les modèles de maladies des voies respiratoires, tels que l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et les modèles de maladies infectieuses. Outre la composition cellulaire, la composition moléculaire des voies aériennes pulmonaires se reflète également dans le fluide BAL. Pour analyser cela, le dosage immuno-absorbant enzymatique (ELISA), l'immuno-tache et l'analyse simultanée de cytokines multiples par un réseau de perles de cytokines peuvent êtreEffectué pour évaluer la présence de cytokines et de chimiokines.
BAL est une méthode bien établie pour étudier l'afflux de cellules inflammatoires dans les modèles animaux inflammatoires de la maladie respiratoire. L'observation d'un afflux cellulaire altéré ( p. Ex. Augmentation des taux de lymphocytes, éosinophiles ou neutrophiles) peut conduire à une meilleure compréhension de la maladie et peut être un paramètre objectif pour évaluer la performance d'une intervention thérapeutique.
L'interprétation précise et reproductible de l'analyse cellulaire BAL exige que le BAL soit correctement exécuté et que le liquide collecté soit manipulé et traité correctement. Le terme «lavage bronchique» a été introduit il y a plus de quatre-vingts ans par Stitt 3 . En 1961, Myrvik a obtenu des macrophages alvéolaires à partir du liquide de lavage des poumons de lapin 3 . BAL est maintenant une méthode couramment utilisée pour analyser et surveiller les poumons dans le modèle de la souris, mais laRe n'est toujours aucun rapport d'une procédure BAL standardisée dans la littérature scientifique 4 , 5 . En outre, il existe probablement autant de façons d'effectuer BAL car il existe des laboratoires de recherche utilisant la technique 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Il est important que les données obtenues à partir du BAL représentent le poumon murin entier et pas seulement une partie du poumon. Ce type de variabilité complique l'interprétation et la comparaison des résultats entre différents essais.
Ici, une procédure BAL basique, peu coûteuse et reproductible est décrite qui permet la collecte de la fraction cellulaire et soluble présente dans la lumière de la souris de la voie aérienne. Bref, un cathéter est placé dans la trachée exposée ofa souris terminale anesthésié. Une seringue est raccordée au cathéter, et une solution saline tamponnée contenant est introduit dans les poumons de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). La lumière du poumon est échantillonné par un léger balayage répété de la solution saline en utilisant le piston. La pression négative appliquée au cours de cette étape est minime pour éviter l'effondrement des voies respiratoires. Après la collecte, la BAL obtenue doit être encore traité pour énumérer et identifier les cellules par cytométrie de flux.
BAL est une technique utile pour obtenir des informations cytologique et biochimiques en réponse à des infections ou des médicaments. Dans un premier temps , BAL a été utilisé pour gérer la production excessive de mucus chez les patients humains souffrant de la toxicité du phosgène 3. De nos jours, la technique est utilisée chez l' homme pour enquêter sur la pathogenèse du poumon, le diagnostic et prise en charge thérapeutique des maladies 3, 24. Chez les animaux de laboratoire, BAL est couramment utilisé pour surveiller les réponses inflammatoires, des mécanismes immunitaires, et des processus de maladies infectieuses qui se produisent dans les voies aériennes pulmonaires 1, 2.
Pour étudier le modèle cellulaire inflammatoire dans les modèles de maladies respiratoires, BAL devrait être suivie par comptage cellulaire absolue et différentielle. En plus du numéro de cellule absolue, le nombre de cellules par rapport sont également intéressantes. Par exemple, les modèles de réparation et cancer montrent vLe nombre de cellules BAL augmente. Dans ce modèle, l'évaluation de la composition cellulaire est utile. En utilisant une coloration cellulaire combinée à un microscope optique, différents types de cellules, tels que les éosinophiles, les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes, peuvent être identifiés en fonction de la morphologie 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . La cytométrie de flux peut être utilisée pour des évaluations spécifiques, telles que l'identification de différents phénotypes de lymphocytes T 7 , 31 . En plus de l'identification des différentes populations de cellules infiltrantes, la composition non cellulaire du poumon peut être étudiée en utilisant BAL. Des méthodes telles que l'ELISA, l'immuno-tache, la matrice de cytokines, l'immunohistochimie et la réaction en chaîne par polymérase quantitative sont effectuées sur le fluide BAL pour déterminer les cytokines, la croissanceDes facteurs et d'autres composants inflammatoires. Pour déterminer les dommages aux poumons, les concentrations totales de protéines et de lactate déshydrogénase dans le liquide BAL peuvent également être mesurées 32 , 33 .
Avec le développement de nouveaux outils de diagnostic, la caractérisation génomique et protéomique des composants BAL sera possible dans un proche avenir. La combinaison d'une capacité de calcul en expansion et de technologies d'expression de gènes à haut débit permettra de définir des profils spécifiques d'expression génique pour divers états pathologiques. L'exécution de ces techniques sur le fluide BAL peut fournir des modèles d'expression des gènes et des protéines pour identifier les molécules importantes impliquées dans les différentes phases des maladies pulmonaires.
La principale limitation des données obtenues à partir du liquide BAL est le manque de comparabilité entre les différents essais de recherche 3 , 9 . Il existe un degré élevé devariabilité de la technique de lavage et le traitement ultérieur de fluide BAL. Pour être en mesure de comparer chaque essai BAL, il est nécessaire de normaliser le type de liquide de lavage qui est inculqué, le site de l'instillation, et la fraction qui doit être analysée pour la composition cellulaire et non cellulaire. Il existe des différences significatives dans le nombre de fractions de lavage entre les différents essais, en faisant varier d'une à 14 fois 34, 35, 36. Cette différence peut avoir un impact sur le nombre total de cellules estimées dans les poumons. Il est important de savoir quelle fraction fluide BAL contient la majorité des cellules. Song et al. a montré qu'environ 70% du nombre total de cellules ont été récupérés dans la fraction de une à trois 22. Cependant, d' autres rapports ont suggéré que le deuxième lavage contenait plus de cellules que le premier 37, 38 </sup>. On peut conclure de ces études qu'un lavage avec une seule fraction ne représente pas l'ensemble du poumon, entraînant une interprétation erronée des résultats.
La composition non cellulaire du fluide BAL contient des informations précieuses sur l'état de santé du poumon 33 , 39 , 40 . Les variations de la dilution du fluide BAL contribuent à la différence de quantification de la fraction soluble et, par conséquent, aux différences dans les résultats entre essais. Song et al. A comparé les niveaux de protéines et de lactate déshydrogénase de chaque fraction de lavage et a conclu que la première fraction de lavage contenait deux à trois fois plus que la seconde fraction.
Pour récupérer un échantillon BAL représentatif pour analyse, certaines considérations techniques sont cruciales. L'un d'eux consiste à effectuer une anesthésie appropriée. Il est très important de vérifier le pied refLex de la souris pour assurer la sédation terminale. Ce n'est pas seulement important pour des raisons éthiques, mais aussi parce qu'il est difficile de placer et de retenir le cathéter dans la position correcte si la souris n'est pas anesthésiée correctement.
Une deuxième considération technique importante est la position du cathéter dans la trachée. Lorsque le cathéter est inséré trop profond, il peut endommager la structure du poumon. L'extrémité distale du cathéter ne doit pas atteindre les poumons pendant la procédure BAL. Le cathéter doit également être stabilisé et attaché avec un fil de coton. Si le cathéter n'est pas stabilisé, la solution saline injectée peut s'écouler vers le haut dans la cavité nasale au lieu de descendre dans les poumons. Pendant l'injection et l'aspiration de la solution saline, il est important de maintenir le cathéter stable.
Les données obtenues à partir du fluide BAL doivent représenter le poumon murin entier. Par conséquent, il est important d'instiller un volume adéquat de tampon salin ( c.-à-d.3 ml, divisé en 3 portions aliquotes de 1 ml chacune). Il n'y a pas de relation linéaire entre le rendement cellulaire et le rendement en fluide BAL. Il est important de collecter la solution doucement tout en massant le thorax de la souris. Si les forces de cisaillement sont trop fortes, la viabilité, la fonction et la structure des cellules dans les voies aériennes et le fluide BAL peuvent être compromises. Si le fluide aspiré n'est pas visible dans la seringue, déplacer soigneusement le cathéter plus profond ou plus haut dans la trachée.
Un avis spécial devrait être donné à des aspects spécifiques du traitement et de l'analyse BAL. Cela permettra de maximiser l'information retenue à partir des échantillons BAL. Après BAL, les cellules sont dans un milieu salin pauvre en éléments nutritifs. Il est donc très important de traiter les échantillons dans les 1 h après l'échantillonnage BAL. Si un stockage prolongé est nécessaire, l'utilisation d'un milieu supplémenté en éléments nutritifs est nécessaire.
Pour préserver la viabilité cellulaire, évitez les tubes qui favorisent l'adhérence cellulaire à la surface. Évitez ceLa ntrifugation des suspensions de cellules à des vitesses susceptibles de compromettre l'intégrité cellulaire ou d'empêcher une resuspension uniforme des cellules BAL récupérées. Les cellules contenant du liquide BAL doivent être centrifugées à 400 xg et 4 ° C pendant 7 min. Il est important de garder à l'esprit que les suspensions de cellules devraient être maintenues à 4 ° C pendant le traitement.
The authors have nothing to disclose.
LVH est un assistant de recherche au Département de biologie moléculaire biomédicale de l'Université de Gand. ERJ est soutenu par UniVacFlu, numéro de subvention 607690. KR est soutenu par le projet EC-FP7 FLUNIVAC.
balanced salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
ethyleendiaminetetra acetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
23G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0,60 x 30 mm |
26G x 1/2 neelde | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0,45*12 mm |
plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100') |
sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
1ml syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | non pyrogenic and non toxic |
Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
centrifuge tube 50 ml | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
centrifuge tube 15 ml | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
microcentrifuge tube 1,5 ml | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile filtered |
live/dead -efluor506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
flow cytometer | BD Biosciences | ||
catheter | BD Biosciences | 393202 |