Özet

целевое<em> В Ситу</em> мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

Published: January 26, 2017
doi:

Özet

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

Четыре основных белков гистонов H2A, H2B, H3, H4 и играют центральную роль в уплотнению, организации и функции эукариотических хромосом. Два комплекта каждого из этих гистонов образуют гистонов октамером, молекулярный катушку , которая направляет оборачивание ~ 147 пар оснований ДНК вокруг себя, в конечном счете , приводит к образованию нуклеосом 1. Нуклеосомы являются активными участниками различных процессов хромосом на основе, например, регуляции транскрипции генов и формирования эухроматином и гетерохроматина через хромосом, и как таковые были в центре внимания интенсивных исследований в течение последних нескольких десятилетий. Ряд механизмов, были описаны, с помощью которых нуклеосомы можно манипулировать такими способами, которые могут облегчить выполнение определенных процессов – эти механизмы включают в посттрансляционной модификации гистонов остатков, АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирование и АТФ-независимую реорганизацию нуклеосоми монтаж / демонтаж 2, 3.

Многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE является особенно мощным модельным организмом для понимания функции гистонов в эукариот. Это может быть в значительной степени связано с высокой степенью эволюционного сохранения гистоновых белков во всей области Eukarya и аменабельности дрожжей до разнообразных генетических и биохимических экспериментальных подходов 4. Реверс-генетические подходы у дрожжей широко используется для изучения влияния специфических мутаций гистонов по различным аспектам биологии хроматина. Для этих типов экспериментов часто предпочтительно использовать клетки, в которых мутантный гистоны, экспрессируемые из их родного геномного локуса, как экспрессия из автономных плазмид может привести к ненормальной внутриклеточных уровней белков гистонов (из-за разного количества плазмид в клетках) и сопутствующее изменение хроматина анvironments, которые могут в конечном счете, запутать интерпретацию результатов.

Здесь мы опишем метод ПЦР на основе, которая позволяет направленного мутагенеза генов гистонов на их родных геномных местах, которые не требуют стадии клонирования и приводит к генерации желаемой мутации (ов) без оставшихся последовательностей экзогенной ДНК в геноме. Этот метод использует преимущества эффективной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей и имеет ряд общих черт с другими подобными методами , разработанными другими группами – в первую очередь на Delitto Perfetto, сайт-специфической геномной (SSG) мутагенеза и клонированию свободной ПЦР на основе аллель методы замены 5, 6, 7. Тем не менее, этот метод описан имеет аспект, который делает его особенно хорошо подходит для мутагенеза генов гистонов. В гаплоидных клетках дрожжей, каждый из четырех основных гистонов кодируется двумя не-Аllelic и высоко гомологичных генов: например, гистона Н3 , кодируемые генами HHT1 и HHT2, и открытые рамки считывания (ORFs) двух генов более 90% идентична последовательности в определенной последовательности. Такая высокая степень гомологии может осложнить эксперименты, направленные на специально направлены одной из двух гистонов генов, кодирующих для мутагенеза. Принимая во внимание вышеупомянутые методы часто требуют использования, по крайней мере некоторых последовательностей в пределах ORF гена-мишени для привода гомологичной рекомбинации, методика описана здесь использует последовательности, фланкирующие ORFs генов гистонов (в которых намного меньше гомологии последовательностей) для стадия рекомбинации, таким образом, увеличивая вероятность успешного нацеливания мутагенеза до нужного локуса. Кроме того, гомологичные регионы, что диск рекомбинации может быть очень обширным, дополнительно способствуя эффективной целевой гомологичной рекомбинации.

Protocol

Примечание: Экспериментальная стратегия направлена на месте гена гистона мутагенеза включает в себя несколько этапов (показаны на рисунке 1). Эти шаги включают в себя: (1) замена гена мишени гистона с геном URA3, (2) Производство и очистка продуктов ПЦР , соответствующих д?…

Representative Results

Описана генерация hht2 аллеля , выражающей мутантный белок гистона H3 укрывают замещение в положении 53 из аргинином к глутаминовой кислоты (Н3-R53E мутант) в качестве типичного примера целевой стратегии Situ мутагенеза. Мы создали ш…

Discussion

Высокий уровень гомологии последовательностей между двумя неаллельных генов , которые кодируют для каждого из четырех основных белков гистонов в клетках гаплоидных S.cerevisiae , может представлять собой проблему для исследователей , которые хотят конкретно адресовано одному из двух …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards) New England BioLabs N3232L
Agarose  Sigma A5093-100G
Boric Acid Sigma B0394-500G
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0) AmericanBio AB00502-01000
Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific 16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E4884-500G
Lithium acetate dihydrate Sigma L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler BioRad 170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer Fisher Scientific 50-443-960
Salmon sperm DNA solution ThermoFisher Scientific 15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form) Sigma T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate Sigma 236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) AmericanBio AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer New England BioLabs M0273X
Toothpicks Fisher Scientific S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0) AmericanBio AB14043-01000
a-D(+)-Glucose Fisher Scientific AC170080025 for yeast media
Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 for yeast media
Peptone Fisher Scientific DF0118-07-2 for YPD medium
Yeast Extract Fisher Scientific DF0127-17-9 for YPD medium
4-aminobenzoic acid Sigma A9878-100G for complete minimal dropout medium 
Adenine Sigma A8626-100G for complete minimal dropout medium 
Glycine hydrochloride Sigma G2879-100G for complete minimal dropout medium 
L-Alanine Sigma A7627-100G for complete minimal dropout medium 
L-Arginine monohydrochloride Sigma A5131-100G for complete minimal dropout medium 
L-Asparagine monohydrate Sigma A8381-100G for complete minimal dropout medium 
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate Sigma A6683-100G for complete minimal dropout medium 
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamic acid hydrochloride Sigma G2128-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamine Sigma G3126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma H8125-100G for complete minimal dropout medium 
L-Isoleucine Sigma I2752-100G for complete minimal dropout medium 
L-Leucine Sigma L8000-100G for complete minimal dropout medium 
L-Lysine monohydrochloride Sigma L5626-100G for complete minimal dropout medium 
L-Methionine Sigma M9625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Phenylalanine Sigma P2126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Proline Sigma P0380-100G for complete minimal dropout medium 
L-Serine Sigma S4500-100G for complete minimal dropout medium 
L-Threonine Sigma T8625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tryptophan Sigma T0254-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tyrosine Sigma T3754-100G for complete minimal dropout medium 
L-Valine Sigma V0500-100G for complete minimal dropout medium 
myo-Inositol Sigma I5125-100G for complete minimal dropout medium 
Uracil Sigma U0750-100G for complete minimal dropout medium 
Ammonium Sulfate Fisher Scientific A702-500 for complete minimal dropout medium 
Yeast Nitrogen Base Fisher Scientific DF0919-07-3 for complete minimal dropout medium 
5-Fluoroorotic acid (5-FOA) AmericanBio AB04067-00005 for  5-FOA medium

Referanslar

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetik. 190 (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetik. 197 (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 122 (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).

View Video