Özet

المستهدفة<em> في الموقع</em> الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

Published: January 26, 2017
doi:

Özet

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

أربعة البروتينات هيستون الأساسية H2A، H2B، H3، H4 وتلعب دورا أساسيا في الضغط، والتنظيم، ووظيفة الصبغيات حقيقية النواة. مجموعتين من كل من هذه الهستونات تشكل octamer هيستون، بكرة الجزيئية التي توجه التفاف ~ 147 أزواج قاعدة الحمض النووي حول نفسها، مما أدى في نهاية المطاف إلى تشكيل جسيم نووي 1. جسيم نووي هي مشاركين نشطين في مجموعة متنوعة من العمليات القائمة على كروموسوم، مثل تنظيم النسخ الجيني وتشكيل كروماتين حقيقي والمغاير في الكروموسومات، وعلى هذا النحو تم التركيز من البحوث المكثفة على مدى العقود العديدة الماضية. وقد وصف عدد من الآليات التي يمكن التلاعب بها جسيم نووي في الطرق التي يمكن أن تسهل تنفيذ عمليات محددة – وتشمل هذه الآليات تعديل posttranslational من بقايا هيستون، ATP التي تعتمد على إعادة عرض جسيم نووي، وإعادة تنظيم جسيم نووي ATP مستقلةوالتجمع / التفكيك 2 و 3.

الخميرة في مهدها خميرة الخباز هي قوية ولا سيما نموذج حي لفهم وظيفة هيستون في حقيقيات النوى. ويمكن أن يعزى ذلك إلى حد كبير إلى درجة عالية من الحفظ التطوري من البروتينات هيستون في جميع أنحاء حقيقيات النوى المجال وقابليته للخميرة لمجموعة متنوعة من التجريبية الجينية والبيوكيميائية النهج 4. وقد استخدمت على نطاق واسع نهج عكس الوراثية في الخميرة لدراسة آثار الطفرات هيستون محددة بشأن مختلف جوانب علم الأحياء لونين. لهذه الأنواع من التجارب غالبا ما يكون من الأفضل استخدام الخلايا التي يتم التعبير عنها في الهستونات متحولة من مواضع الجيني الأصلي لها، والتعبير عن البلازميدات مستقلة يمكن أن يؤدي إلى مستويات غير طبيعية داخل الخلايا من البروتينات هيستون (بسبب وجود عدد من البلازميدات متفاوتة في الخلايا) و تغيير يصاحب ذلك من لونين أونvironments، والتي يمكن أن نخلط في نهاية المطاف تفسير النتائج.

هنا، نحن تصف تقنية PCR القائم الذي يسمح لالطفرات الموجهة للجينات هيستون في مواقع الجينومية الأصلية الخاصة بهم والتي لا تتطلب خطوة الاستنساخ والنتائج في جيل الطفرة المطلوبة (ق) من دون بقايا تسلسل الحمض النووي الخارجية في الجينوم. هذا الأسلوب يستفيد من نظام إعادة التركيب مثلي كفاءة في الخميرة، ولها عدة سمات مشتركة مع غيرها من التقنيات المشابهة التي وضعتها المجموعات الأخرى – وأبرزها Delitto بيرفيتو، الجينوم (SSG) الطفرات في مواقع محددة، وخالية استنساخ أليل القائم على PCR طرق استبدال 7. ومع ذلك، فإن تقنية وصفنا لها الجانب الذي يجعل من وبخاصة مناسبة تماما لالطفرات الجينات هيستون. في خلايا الخميرة فرداني، يتم ترميز كل من histones الأساسية الأربعة من قبل اثنين من غير على بعدالجينات llelic والمتجانسة للغاية: على سبيل المثال، يتم ترميز H3 هيستون بواسطة الجينات HHT1 وHHT2، وإطارات القراءة المفتوحة (ORFS) من الجينات هما أكثر من 90٪ مماثلة في التسلسل. هذه درجة عالية من التماثل يمكن تعقيد التجارب المصممة خصيصا لاستهداف واحد من اثنين من جينات ترميز هيستون عن الطفرات. في حين أن الطرق المذكورة أعلاه وغالبا ما تتطلب استخدام بعض ما لا يقل عن تسلسل داخل ORF من الجين المستهدف لحملة إعادة التركيب مثلي، والتقنية وصفنا هنا يجعل من استخدام تسلسل المرافقة ORFS من الجينات هيستون (التي تشترك أقل بكثير تسلسل تناظر) ل الخطوة إعادة التركيب، مما يزيد من احتمال استهداف ناجح من الطفرات إلى مكان المطلوب. وعلاوة على ذلك، يمكن للمناطق متماثلة التي تدفع إعادة التركيب تكون واسعة جدا، مما يسهم في كفاءة إعادة التركيب مثلي المستهدفة.

Protocol

ملاحظة: استراتيجية تجريبية لالمستهدفة في الموقع الطفرات هيستون الجين تتضمن عدة خطوات (ملخصة في الشكل 1). وتشمل الخطوات التالية: (1) استبدال الجين هيستون الهدف مع الجينات URA3، (2) جيل وتنقية المنتجات PCR المقابلة لاثنين من شظايا متداخلة جزئيا من الجين هي?…

Representative Results

نحن تصف الجيل من أليل hht2 تعبر عن هيستون H3 البروتين متحولة إيواء إجراء تبديل في موقف 53 من أرجينين إلى حمض الجلوتاميك (H3-R53E متحولة) كمثال التمثيلي للالمستهدفة في استراتيجية الموقع الطفرات. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;d…

Discussion

على مستوى عال من تسلسل تناظر بين الجينين غير أليلية أن رمز لكل من البروتينات هيستون الأساسية الأربعة في الخلايا البيرة س فرداني يمكن أن تمثل تحديا للمحققين الذين يرغبون خصيصا لاستهداف واحد من اثنين من الجينات لالطفرات. سبق وصفها منهجيات الطفرات الخميرة، بما في …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards) New England BioLabs N3232L
Agarose  Sigma A5093-100G
Boric Acid Sigma B0394-500G
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0) AmericanBio AB00502-01000
Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific 16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E4884-500G
Lithium acetate dihydrate Sigma L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler BioRad 170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer Fisher Scientific 50-443-960
Salmon sperm DNA solution ThermoFisher Scientific 15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form) Sigma T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate Sigma 236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) AmericanBio AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer New England BioLabs M0273X
Toothpicks Fisher Scientific S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0) AmericanBio AB14043-01000
a-D(+)-Glucose Fisher Scientific AC170080025 for yeast media
Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 for yeast media
Peptone Fisher Scientific DF0118-07-2 for YPD medium
Yeast Extract Fisher Scientific DF0127-17-9 for YPD medium
4-aminobenzoic acid Sigma A9878-100G for complete minimal dropout medium 
Adenine Sigma A8626-100G for complete minimal dropout medium 
Glycine hydrochloride Sigma G2879-100G for complete minimal dropout medium 
L-Alanine Sigma A7627-100G for complete minimal dropout medium 
L-Arginine monohydrochloride Sigma A5131-100G for complete minimal dropout medium 
L-Asparagine monohydrate Sigma A8381-100G for complete minimal dropout medium 
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate Sigma A6683-100G for complete minimal dropout medium 
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamic acid hydrochloride Sigma G2128-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamine Sigma G3126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma H8125-100G for complete minimal dropout medium 
L-Isoleucine Sigma I2752-100G for complete minimal dropout medium 
L-Leucine Sigma L8000-100G for complete minimal dropout medium 
L-Lysine monohydrochloride Sigma L5626-100G for complete minimal dropout medium 
L-Methionine Sigma M9625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Phenylalanine Sigma P2126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Proline Sigma P0380-100G for complete minimal dropout medium 
L-Serine Sigma S4500-100G for complete minimal dropout medium 
L-Threonine Sigma T8625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tryptophan Sigma T0254-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tyrosine Sigma T3754-100G for complete minimal dropout medium 
L-Valine Sigma V0500-100G for complete minimal dropout medium 
myo-Inositol Sigma I5125-100G for complete minimal dropout medium 
Uracil Sigma U0750-100G for complete minimal dropout medium 
Ammonium Sulfate Fisher Scientific A702-500 for complete minimal dropout medium 
Yeast Nitrogen Base Fisher Scientific DF0919-07-3 for complete minimal dropout medium 
5-Fluoroorotic acid (5-FOA) AmericanBio AB04067-00005 for  5-FOA medium

Referanslar

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetik. 190 (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetik. 197 (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 122 (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).

View Video