Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün – protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.
Nükleozom histon proteinleri bir oktamer sarılı DNA 147 baz çifti oluşan kromatin küçük yapısal birimi vardır. Histon fonksiyonu, nükleer proteinlerin sayısız tarafından kapsamlı post-translasyonel modifikasyon aracılık eder. Onlar gen regülasyonu, DNA tamiri ve kromozom yoğunlaşma katılan kromatin yapısı ve işe enzimleri düzenleyen olarak bu değişiklikler, nükleer bütünlüğü için kritik öneme sahiptir. bilimsel topluluğun büyük bir kısmı histon PTM bolluk karakterize etmek antikor bazlı teknikleri benimser olsa epitop yakın değişikliklerle engel olabileceği gibi, bu yaklaşımlar, düşük verimlilik ve hypermodified proteinlere karşı önyargılı. Bu protokol, histon modifikasyonlarının tayini için daha kesin nano sıvı kromatografisi (nlC) ve kütle spektrometrisi (MS) kullanımını tarif etmektedir. Bu yöntem, histon PTMS çok çeşitli ve çok sayıda histonun göreceli olarak karakterize etmek için tasarlanmıştır s içinde varyantlarıingle analiz eder. uzunluğu 20 AA – Bu protokol, histonlar 5 peptidleri üretmek üzere tripsin ile sindirme ile ve ardından propiyonik anhidrid ile türetilir. Sindirimden sonra, histon peptitlerin yeni maruz kalan N-termini nlC-MS sırasında kromatografık tutma özelliğinin geliştirilmesi için türetilir. Bu yöntem, dört büyüklük düzeyinde kapsayan, histon PTMS rölatif ölçümü sağlar.
Epigenetik altta yatan DNA dizisi 1. değiştirerek dışındaki mekanizmalar ile ortaya çıkan, gen ekspresyonunda kalıtımsal değişikliklerin çalışma olarak tanımlanır. Organizma dramatik fenotipik kendi DNA içeriği değişmez olsa bile değiştirir uğrar gibi epigenetik düzenleme gelişimi sırasında kritik önem taşımaktadır. Farklı mekanizmalar 2 vasıtasıyla gen ekspresyonunu etkileyen her biri histon post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), histon varyantları, kodlayıcı olmayan RNA'lar, DNA metilasyonu ve DNA bağlama faktörler de dahil olmak üzere uygun bir epigenetik bakımı için gerekli kritik bileşenleri vardır. Örneğin, ise DNA metilasyonu geni çeviri 3, histon varyantları ve histon PTMS daha dinamik ve şekillerde 4 çeşitli kromatin etkileyebilir bastıran oldukça dengeli bir modifikasyonudur.
en çok maruz kalan ve esnek bölgesi olarak Histon PTMS çok N-terminal kuyrukları lokalizeprotein. Ancak, nucleosome çekirdek de ağır ortalama proteinler 5 ile karşılaştırıldığında modifiye edilir. histon işaretleri yaygın son on yılda karakterize edilmiştir olsa da, bilinen histon işaretleri ve bunların fonksiyonu arasındaki birçok bağlantılar hala belirsiz. Bu en histon PTMS transkripsiyon 6,7 gibi belirli bir süreç değiştirmek için diğer PTMS ( "cross-talk") ile tandem oldukça işlevi yalnız çalışmak değil, gerçeği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Örneğin, gen p21 ile kombinasyon işareti H3S10K14ac iki PTMS 8 yalnızca birinde ortaya değil, transkripsiyonu aktive eder. Protein HP1 sıkıştırır H3K9me2 / Me3'ten seçilen tanıma ve yakındaki nükleozom için değişiklik yayarak kromatin. Bitişik S10 9 fosforile olduğunda ancak, HP1 H3K9me2 / 3 bağlamak mümkün değil. H3K4 asetilasyonu Schizosaccharomyces pombe 10 H3K9me2 / Me3 protein spChp1 bağlanmasını engeller. Ayrıca, histon lizin Demethylase PHF8 üç PTMS H3K4me3, K9ac ve K14ac 11, bu en yüksek nükleozom bağlayıcı etkinliğe sahiptir. Bu örnekler histon PTM değişikliklerin küresel bir bakış elde ziyade tek değişiklikler odaklanarak önemini vurgulamaktadır.
dizinin varlığı da varyantları histon izotipleri genellikle oldukça benzer dizilere sahip olarak, histon analiz karmaşıklığını artırır, ancak genellikle kromatin farklı rollere sahiptir. Örneğin, H2A.x daha kolay kanonik H2A 12 göre DNA hasarı üzerine fosforilatlanır bir C-terminal dizisine sahiptir, ve erkek farenin mayoz 13 cinsiyet kromozom inaktivasyonu için gereklidir; Benzer şekilde, CENP-A sentromer 14 kanonik histon H3 yerini alır. Farklı fonksiyonların rağmen, bu varyant belirlemek ve bunları ayrı ayrı ölçmek güçleştirir ilgili standart histon ile amino asidi dizisinin büyük bir bölümünü paylaşmaktadır. </p>
Böyle batı blot olarak antikor bazlı teknikler yoğun histon karakterize etmek kabul edilmiştir. Bununla birlikte, antikor bazlı yaklaşımlar, aşağıdaki nedenlerden dolayı sınırlıdır: (i) sadece modifikasyon varlığını teyit edebilir ve bilinmeyen PTMS belirleyemez; (Ii) bağlı bir bağlanma afinitesine etkileyebilir birlikte mevcut olan bakışı varlığında şekilde bastırılmaktadır; (iii) sadece çok az sayıda antikorlar, amacı ve (iv) çok benzer histon varyantları ya da benzeri PTMS (örneğin, di- ve lizin kalıntılarının trimethylation) arasındaki çapraz reaksiyona için uygun olarak, kombinasyon işaretleri tespit edilemez. Egelhofer ve ark. Ticari antikorların% 25'ten fazla nokta leke veya Western blot ile özgüllük testleri başarısız ve spesifik antikorlar arasında% 20'den fazla kromatin immüno deneyler 15 başarısız tanımlanmıştır. Kütle spektrometrisi (MS) şu anda, yeni ve / veya kombinasyon PTMS çalışma için en uygun bir analitik araç olduğunuve yaygın (16 gözden) histon proteinler için uygulamaya konmuştur. Bu, yüksek hassasiyet ve MS kütle hassasiyeti, ve büyük ölçekli analiz gerçekleştirmek için olasılığı çok bağlıdır.
(- 20 aa 5) aşağıdan yukarı bir strateji Sağlam protein enzimatik kısa peptitler sindirilmiş burada histon karakterizasyonu ve PTMS için en yaygın olarak kullanılan MS tabanlı proteomik stratejidir. Bu sindirim LC ayrılması ve MS algılama hem de kolaylaştırır. 600 aralığında Kitleler – 2000 Da yaygın daha kolay iyonize ve daha geniş kitlelere daha yüksek kitle doğruluk ve çözünürlük ile tanımlanır. MS / MS parçalanması da kısa peptidler genellikle Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) için çok uygundur, artırıldı. Bunlar son derece bazik amino asit kalıntısı, yani lisin ve arginin açısından zengin olan Ancak, histonlar aşağıdan yukarı MS için sorunlara neden olabilmektedir. Bu nedenle, bir şekilde tripsin emdirme çok sm olan peptidlerin oluşumuna yol açantüm LC tutma ve PTMS kesin lokalizasyonu için. Bu sorunu aşmak için, bizim protokol lizin ve peptit N-terminal kimyasal türetme 17 içermektedir. Propiyonik anhidrid kullanılması diğer reaktifler 18 ile karşılaştırıldığında etkili kimyasal türetme için tavsiye edilir. Tripsin, sadece arginin kalıntılarının, C-terminalindeki proteolizini gerçekleştirmek için izin Bu türetme blok edilmemiş ve monometil lizin kalıntılarının ɛ-amino grupları. Türetilmiş aminler çözümü ile protonları alışverişi olamaz ve bu nedenle peptitler genellikle sadece çift veya triply MS ve MS / MS algılama kolaylaştırmak, tahsil edilir. Ayrıca, N-terminal türetme peptit hidrofobiklik ve böylece ters faz kromatografik arttırır. Burada, histon arındırmak ve aşağıdan yukarıya proteomik (Şekil 1) üzerinden PTM analiz için onları hazırlamak için iş akışını açıklar. Bu strateji, tek histon işaretleri ve kombinasyon işaretleri f miktarının eldeamino asit dizisinde nispeten yakın olan ya da histon PTMS.
Burada açıklanan protokol maliyetleri, zaman ve performans dikkate alınarak optimize edilmiştir. Diğer preparasyonlar da mümkündür, ancak bunlar, özellikle MS analizi ile bağlanması durumunda, sınırlamaları vardır. Örneğin, yüksek tuz ekstraksiyon protokolü histonlar 26 yerine, TCA çökeltisi (bölüm 3) saflaştırmak için kullanılabilir. güçlü asit kullanmak değildir gibi yüksek tuz protokolü, özünde hafif olduğunu. Bu asit-labil PTMS koruyan ve TCA çökeltisi olarak, ekstre histonların verim artar diğer kromatin bağlayıcı proteinleri birlikte çökelir. Bununla birlikte, yüksek tuzlu ekstraksiyon HPLC-MS / MS çok konsantre tuzlu ihtiva eden numuneler yol açar. Tripsin inkübasyon süresi ve enzim / substrat oranı 27 azaltılması veya sindirim enzim 28-30 kadar argc kullanılarak, örneğin, – Alternatif bir preparasyonda, histon sindirim propionylation (8 Bölüm 6) olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, propiyonik anhidrid ile türetme, i önerilmektedirt iyi sıvı kromatografisi sırasında korunur daha hidrofobik peptitler oluşmasına sebep olur.
Kimyasal türetme, organik asit anhidritleri, çeşitli değerlendirilmiştir ve yararları kapsamlı 18 ele alındı. Bununla birlikte, propiyonik anhidrit verimliliği, minimize yan ürünleri ve gelişmiş peptid hidrofobisite arasında en iyi uzlaşma kanıtladı. Potansiyel olarak, propionik anhidrid izotopik olarak etiketli halde satın alınabilir; bu durum birden fazla numune karıştırma ve ağır etiketten kazandırılan farklı kitlelere dayanan MS düzeyinde onları ayırmak olasılığına çoklayıcı analiz sağlar. Ancak bu analiz, LC-MS kromatogramının artan karmaşıklığı yol açar ve her bir durum için enjekte edilebilir numune miktarını azaltır.
Bu bağlamda, protokol bazı kritik yönleri vurgulanmalıdır. Aşağıdaki CH gibi kullanılmalıdırnegatif sonuçlar elde edilmektedir halinde işlemi gerçekleştirmeden hataları bulmak için ecklist. İlk olarak, çekirdek yağış sonrası pelet dikkatlice NP-40 Alternatif (karıştırma esnasında kabarcıkların eksikliği fark) deterjan tamamen kaldırılması kadar (bölüm 2.10) olmadan ELVES ile yıkanmalıdır. bunu başaramayınca asitlerle histon çıkarma taviz verecek. İkinci olarak, TCA ile histon yağış (bölüm 3.9) aseton ile pelet yıkar sonra çok önemlidir. propionylation ve sindirim (bölüm 6.1) doğrudan yapılması halinde konsantre asit varlığı aşağıdaki adımı zarar verecektir. (Bölüm 5) gerçekleştirilir durumda histon ayrıştırmada değil sorunlu olacaktır. (- 6.7 bölüm 6.3) Üçüncü olarak, propionylation Reaksiyon hızlı bir şekilde gerçekleştirilir esastır. 4 ardışık numunelerin – Bunu yapmak için, en fazla 3 için aynı propionylation karışımı (propiyonik anhidrit + asetonitril) kullanmaktan kaçının. Ayrıca, pH tripsin sindirim (bölüm 7) en önemli yönüdür. değilse8.0 (7.5 – 8.5) etrafında sindirim etkisiz olacaktır. Numune bu aşamada propiyonik asit açısından zengin olacak gibi bu, olabilir. NH4OH gerektiğinde kadar ilave edilebilir. Ayrıca, proteomik iş akışları aşina araştırmacılar için tripsin sindirimi sonlandırmak için numunesi asitler normal hissedeceksiniz. Aşağıdaki reaksiyon, örneğin, peptid N-uçlarının (bölüm 8.1) propionylation tehlikeye gibi bu yapılmamalıdır. Son olarak, aynı konuda, o değiştirilmemiş peptitler gerçekten değiştirilmemiş olmayan veri analizi için hatırlamak önemlidir; tüm serbest lizin kalıntıları ve N-termini propionylation (56,026 Da) tarafından işgal edilecektir. Bu durumda, Peptid sekansına sadece karşı kitle çıkarma iyon kromatografisi performanstan sonuçlara neden olacaktır.
yöntemin sınırlamaları gerçek ABUN ulaşmada önyargılar nedeniyle kısa peptid dizileri, birleştirici PTMS tespit yetersizlik çoğunlukla ilişkilidir veFarklı modifiye formlarda peptidler, farklı etkinliklerine sahip iyonize olabilir olması nedeniyle bir değişiklikten dans. Ilk konu orta-down ya da (16 gözden) yukarıdan aşağıya bir yaklaşımla bu tekniği birleştirerek çözülebilir. bile teknik olarak daha zor, Bu tip analiz, modifikasyon birlikte varlığı frekanslarını çalışmak için idealdir. Ayrıca, bazı peptitler, farklı histon türevleri aynı sekansa sahip yana zaman tabandan yukarı elde edilemez histon varyantları, daha iyi ayırt edilmesini sağlar. Iyonlaşma verimliliği ile ilgili ikinci mesele, sentetik peptidler 31 bir kütüphane kullanılarak çözülebilir. Bu yaklaşım, histon PTMS görece bolluğu daha doğru bir tahmin sağlar. Ancak, çoğu deneylerde, istenen sonucu analiz koşulları arasında verilen değişiklikler göreli değişikliklerdir. Bu durumda, böyle bir korelasyon nedeniyle parçaların aynı Bia sahip olması gerekli değildir,s.
Sonuç olarak, bu protokol tandem MS bağlanmış NLC kullanarak 3 gün içinde tamamlanabilir histon PTMS analizi için izin verir. MS dışındaki teknikleri ile yapılan karşılaştırmalar, yani onlar hacmi bile neredeyse bu seviyeye ulaşmak olamaz girişte tartışıldığı gibi antikor bazlı stratejileri kullanarak, uygun değildir. Buna ek olarak, antikor tabanlı teknikler yeni değişiklikler keşfi için izin vermez, ama onlar sadece teyit ve tahmin işaretleri miktarının dayanmaktadır. Böylece ayar gen ekspresyonu kahramanları olan histon işaretleri, düzenlenmesi bilerek nedeniyle sezgisel avantajları proteomik laboratuarlarında popülerlik kazanmaya ve böylece proteom düzenlenmesini etkileyecek histon peptidler o aşağıdan yukarıya proteomik spekülasyon. Ayrıca, protokol açıklanan laborant için de histon analizi daha önemsiz hale veri analizi için numune hazırlama ve yazılım son gelişmeleri içerirhypermodified peptidlerin bu tür karakterizasyonu yaşamamış Tories.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibe (DP2OD007447, R01GM110174 ve R01AI118891) fon tarafından desteklenmiştir.
Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 25200056 | For harvesting cells |
PBS | Invitrogen | 14200075 | |
Tris | Roche | 77-86-1 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
Calcium Chloride, anhydrous | Sigma | C1016 | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
AEBSF | EMD Millipore Corp | 101500 | |
Microcystin | Sigma | M4194 | |
Sodium Butyrate | Sigma | B5887 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) | Fisher Scientific | 78445 | |
NP-40 Alternative | CALBIOCHEM | 492016 | |
Sulfuric Acid, ACS grade | Fisher Chemical | 7664-93-9 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
Acetone | Sigma | 179124 | |
HCl | Fisher Chemical | A144-500 | |
Bradford reagent | Biorad | 500-0006 | |
30% acrylamide/bis 29:1 — 500ml | Biorad | 1610156 | |
Coomassie | Fisher Scientific | 20278 | |
C18 Column (5um) 2.1mm x 250mm | Grace | 218TP52 | |
C18 Column (5um) 4.6mm x 250mm | Grace | 218TP54 | |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 338818 | |
propionic anhydride | Sigma | 240311 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | PRV5113 | For digesting histones for MS |
Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
C18 extraction disk | Empore | 2215 | |
Formic Acid | Sigma | F0507 |