We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Фосфолипиды являются основными компонентами клеточных мембран и органелл мембран и текучесть этих слоев мембран часто влияет на клеточные функции изменения активности мембранных белков 1 – 3. Например, мембраны гомеостаза липидов достигается путем регулирования текучесть мембран, который обнаруженный мембранных белков, и ненормальный уровень текучести вызывает тяжелые заболевания, такие как стеатоз печени и холестаза 4. Кроме того, текучесть фосфолипидного монослоя на границе жидкости с воздушным альвеолы имеет важные последствия в своих функций. Высокая текучесть легких поверхностно фосфолипидов монослоя облегчает распространение слоя во время вдоха, в то время как текучесть при низких позволяет слой, чтобы остаться в альвеолах во время выдоха 5,6. Таким образом, важно, чтобы оценить текучесть фосфолипидных слоев, чтобы понять свои роли.
_content "> прямой мерой текучести является вязкость, а вязкость фосфолипидных слоев было измерено с помощью микронного размера коллоидных магнитных 7, иглы 8,9 и магнитные микро- кнопки 6,10,11. Однако эти методы ограничены относительно жестких пленок, и не может измерить менее вязкой пленки. В таких случаях диффузии бы быть альтернативой для количественного текучесть фосфолипидных слоев. В течение нескольких десятилетий, различные методы для измерения диффузионных свойств фосфолипидных слоев были разработаны, таких как флуоресценции методом закалки 12, ЯМР градиента импульсного поля 13 и флуоресценции корреляционной спектроскопии (FCS) 14. Один из самых представительных методов восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) 15,16. Благодаря простоте процедуры измерения и связанные с ними теории, несколько исследований по диффузии свойств фосфолипидных слоев были выполнены с помощью FRAP <suр> 17 – 19. Тем не менее, FRAP обычно требует дорогостоящего установки конфокальной микроскопии с лазером высокой мощности.Здесь мы представляем новую технику, чтобы измерить боковой диффузии фосфолипидов монослоев, называемых также восстановления флуоресценции после слияния (FRAM). Ключевое различие между FRAP и FRAM является то, что шаг фотообесцвечивание заменяется раскрывающегося слияния. Слияние капельку покрытый без флуоресценции монослоя на флуоресцентно меченного плоской монослоя оставляет круговой темное пятно на светлом плоской монослоя, таким образом, создание того же начального состояния с шагом фотообесцвечивания. Затем мы наблюдаем восстановление флуоресценции в темное пятно со временем измерения бокового диффузии. Это новое "отбеливание" шаг за падения коалесценции обеспечивает значительные преимущества по сравнению FRAP: FRAM требует только флуоресцентного микроскопа, а не дорогой конфокальной микроскопии с высокой мощности лазера, необходимой для FRAP. Ян Кроме того, FRAM имеет широкий выбор флуоресцентных красителей, так как оно не связано с процессом фотообесцвечивания. Наконец, два различных монослоев, капелька монослой и плоский монослой, могут быть получены независимо, таким образом позволяя взаимной диффузии должна быть измерена, а FRAP измеряет только самодиффузии монослоев.
FRAM обеспечивает широкий диапазон измерений диффузии из вязких материалов для почти невязкой материалов. В принципе, FRAM может измерить максимальное диффузии 10 6 мкм 2 / с, что сравнимо с существующими методами, когда диффузия происходит по всей территории 100 мкм на 100 мкм в течение времени для процесса падение слияния (~ 10 мс). Кроме того, медленный процесс диффузии может быть легко измерены, если монослои не являются твердыми. FRAM может использоваться для любых видов поверхностно-активных веществ тех пор, пока соответствующие флуоресцентно меченые молекулы имеются.
FRAM разделяет много фундаментальных принципов с FRAP, особенно для измерения флуоресценции восстановления после отбеливания удельную, но FRAM использует процесс слияния капельку на плоской поверхности, чтобы сформировать беленой площадь, вместо применения интенсивной свет. Процесс, таким образом, объединение наиболее важным шагом в FRAM, и в особенности, форма пятна на темном плоской монослоя после объединения капли определяет точность измерения диффузии. В частности, на основе текущего метода, мы только установить круг с радиусом R в области, представляющей интерес для расчета средней интенсивности темным пятном, показанный в процедуре 4 и, если есть слишком много отклонение от круглой формы, это будет мешать точное измерение коэффициента диффузии. Таким образом, это необходимо для получения круглой формы темной области, но, некруговые формы образуются от времени по нескольким причинам. Во-первых, если существует конвективный поток в ПитомецRI тарелки, форма темной области удлиняется по направлению потока. Как уже упоминалось в процедуре 1.3, конус-формы Устройство помогает подавить конвективный поток, и это удлинение будут сведены к минимуму. Во-вторых, если верхний конец капилляра касается плоский интерфейс во время процесса слияния, темная область образована с разнообразием форм с конца капиллярного прерывает процесс слияния. По получении капли, что только висит с самого конца капилляра, это прерывание может быть предотвращено. В частности, гидрофобная обработка капилляра помогает капельку, чтобы сидеть в самом конце капилляра. Таким образом, выше неисправностей съемки и модификации позволит более точно измерить свойства диффузии.
Таким образом, этот хорошо диагностирован процесс позволяет FRAM иметь несколько значительные преимущества по сравнению FRAP. Во-первых, FRAM требует простой оборудования по сравнению с FRAP. Для FRAM, достаточно использовать простые флуоресценции микроскопиисправиться, вместо дорогого конфокальной микроскопии с помощью лазера высокой мощности, длина волны которого должен соответствовать спектру поглощения красителя. Кроме того, необходимо использовать дополнительное устройство для регулировки размера в области отбеленной в FRAP, в то время как FRAM контролирует размер области легко регулировать размер капли, или поверхностное давление на поверхности капли. Во-вторых, можно использовать различные виды красителей в FRAM. FRAP использует только молекулы красителя которых отбеливание процесс гораздо быстрее, чем процесс диффузии. Если диффузия красителей во время процесса отбелки, трудно оценить свойства диффузии точно. Фрама, однако, не требует процесса для отбеливания красителей, и это, таким образом, позволяет использовать различные типы красителей в флуоресценции. Кроме того, FRAP требует дополнительных лазеров высокой мощности и наборы фильтров, чтобы изменить вид красителя, а необходимо лишь заменить наборы фильтров в FRAM. в заключение, Так как монослоев на поверхности капелек и плоской поверхности может быть сформирован независимо, что позволяет изучение взаимной диффузии или перемешивания между двумя различными монослоев липидов путем слияния А-типа монослой на B-типа монослоя, в то время как FRAP измеряет только самодиффузии монослое.
Несмотря на эти преимущества, процесс слияния капельку на плоской поверхности воздух-вода потенциально могут ограничить эту технику из-за нескольких проблем, которые могли бы представлять интерес, таких как несоответствие поверхностного давления между двумя монослоев, на временной шкале процесса слияния и увеличение поверхностного давления плоской монослоя после слияния капель. Эти вопросы, однако, не влияет на измерение диффузии значительно по следующим причинам. Во-первых, несмотря на то, поверхностные давления на двух различных монослоев совершенно разные, процесс установления равновесия завершается в очень ранней стадии в процессе восстановления. Например, если тОн поверхностное давление монослоя на поверхности капли, выше, чем в монослое на плоской поверхности раздела воздух-вода, темная область расширяется, пока давление не уравновешивает поверхность. Так как этот процесс будет завершен в течение 10 мс, поверхностное давление будет уравновешена до того, как существенно влияет на процесс диффузии. Во-вторых, если масштаб времени процесса слияния достаточно быстро, это не ограничивает измерение диффузии вообще. К счастью, типичный процесс объединения также завершен в течение 10 мс. Наконец, даже нескольких слияние капель на плоской поверхности не увеличить давление поверхности, так как площадь поверхности желоба намного больше, чем площадь поверхности капли. В соответствии с размерами желоба и капель, описанной в протоколе, площадь на молекулу увеличивает меньше 0,015% путем слияния капли. Соответственно, увеличение поверхностного давления в связи с изменением площади на молекулу составляет менее 0,1%, что negligiblе потому, что это намного меньше, чем типичный ошибки в поверхностном давлении, как измерено Пластинка Вильгельми тензометра.
В целом, мы ввели новый метод для измерения бокового диффузионного свойство фосфолипидов монослоя путем слияния капли монослой на плоской поверхности. Этот метод требует относительно простое оборудование, а также позволяет использовать различные виды видов красителей. Фрама, таким образом, потенциально применимы для диффузии измерения любых поверхностно-активных веществ, в том числе фосфолипиды, блок-сополимеры, белки и даже наночастиц на границе раздела жидкость-жидкости. Кроме того, мы ожидаем, что FRAM обеспечивает новый способ изучения взаимной диффузии или перемешивания между двумя различными поверхностно-активных агентов.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается КАИСТ финансируемого К-Долина RED & B Проекта 2014 и исследовательской программы фундаментальной науки в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |