액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

주의 : 발암 아세톤, 클로로포름을 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 플랫 공기 – 물 인터페이스에서 인지질 단층 1. 준비 인지질 단층의 형성 인지질 용액의 제조 아세톤, 에탄올, 탈 이온수 3 회 이상을 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 코팅 캡 유리 병, 물을 제거하기 위해 유리 병에 충분히 질소 가스를 불어 ㎖로 4를 청소합니다. 인지질을 1 ㎎을 용해 (예 dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) 바이알에 클로로포름 1 ㎖에 1 밀리그램 / ㎖의 농도를 얻었다. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. 인지질 솔루션의 낮거나 높은 농도 (필요한 경우)를 사용합니다. 추가 염료는 인지질 태그 (예를 들면, 로다 민 dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 로다 민 DPPE) 인지질 SOLU의 1 몰 %와기, 형광 현미경으로 인지질 단층을 시각화하기 위해서. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. 용매의 증발을 방지하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 테이프로 감싸 바이알, 및 -20 ℃에서 냉동고에 샘플을 저장한다. 공기 – 물 인터페이스 상에 인지질의 증착 배양 접시 (직경 55mm, 높이 12mm) 에탄올, 및 탈 이온수 3 회 이상 세척. 공기 – 물 계면을 만드는 탈 이온수 10 ml의 배양 접시를 채운다. 원하는 표면 압력을 달성하고 종래 실험 일에, 용매를 완전히 증발 적어도 30 분간을 기다려야 깨끗한 인터페이스 상에 마이크로 주사기 인지질 용액 몇 ㎕를 확산. 주 : 랭 뮤어 통은 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우 대신 페트리 접시로 사용될 수있다. 스와rface 압력 측정 윌 헬미 플레이트 장력과 인지질 단분자막의 표면 압력을 측정한다. 여과지 빌헬 판으로서 사용되는 경우 여과지 충분히 습윤 얻을 적어도 30 분 동안 기다려. 자세한 프로토콜은 쿤 등에서 사용할 수 있습니다. (20). 정확히 표면 압력을 제어하는​​ 인지질의 퇴적 량을 조정한다. ~ 5 mN의 / m 면압의 경우 계면의 30.25 cm 2 – 지역 상 DOPC 용액 (1 ㎎ / ㎖) 4 μl를 추가하는 것이 요구된다. 주 : 여과지가 완전히 습윤되지 않는 경우, 표면 압력 때문에 여과지의 중량 변화를 실험의 처음 30 분 동안 극적으로 변화시킨다. 단층의 대류 유동을 최소화 페트리 접시의 큰 부분에 연결된 두 개의 얇은 채널을 3mm 저수지를 포함하는 원뿔 모양의 장치를 사용하여,의 대류 흐름을 억제모폴로지 촬상 표면 압력 측정을 방해 할 수 단층. 인지질은 공기 – 물 계면에 인지질을 증착하기 전에 전체 영역에 걸쳐 자유롭게 이동되도록 원추형 장치의 내부와 외부 사이의 수위 일치하십시오. 방울의 곡면에 인지질 단분자막 2. 제조 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관의 프로세스 테이퍼 마이크로 피펫 풀러의 모세관 홀더에 유리 모세관 (외경 1mm, ID 0.78 mm, 길이 100mm)을 놓습니다. (: 차, 램프 : 60, VEL : 70, 지연 : 열 (70) 및 압력 200) 적절한 매개 변수 값으로 모세 혈관을 당겨위한 프로그램을 설계 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 설계 프로그램과 모세 혈관을 잡아 당깁니다. 주 : 모세관이 수 마이크로 미터 직경으로 끝나는 것은 APPL 의해 100 μm의 방울을 형성 할 필요가있다~ 10 kPa의 압력을 가진 잉. 모세관의 선단이, 훨씬 높은 압력,> 600 kPa의 너무 작은 경우는 너무 큰 모세관 선단으로 소적의 크기를 제어하기 어려운 반면, 적을 얻기 위해 요구된다. 액적 표면에 흡수 인지질 주 : 방울의 만곡 계면 인지질 단층을 형성하기 위해, 염료없이 인지질 용액을 첨가 절차 (1)에 의해 제조, 플랫 단층에 대하여, 강도 콘트라스트를 얻기 위해 사용 두 절차 2.2.1 및 2.2 인지질 태그 .2 여기에 허용됩니다. 액적 표면에서의 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우, 절차 2.2.2 추천된다. 그러나 그렇지 않은 경우, 절차 2.2.2보다 훨씬 쉬운 방법입니다 절차 2.2.1, 유용합니다. 팁 끝 부분에 인지질의 과정을 코팅 아세톤, 에탄올, 및 탈 이온수를 적어도 세 번 사용하여 슬라이드 유리를 청소. 경기 수세정 슬라이드 글래스에 테이퍼 모세관 에이스, 및 선단부와 슬라이드 글라스를 만지고 촉진하는 모세관 기울. 유리 주사기를 사용하여 유리 슬라이드에 부착 모세관의 선단에 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)을 몇 방울 떨어 뜨리 및 용매를 완전히 증발 적어도 30 분을 기다린다. 주 : 매우 선단 둘레 만 모세관 력에 의해 선단 인지질 방울을 잡고 너무 작아서 절차 2.2.1.3 중에 유리 슬라이드에 모세관의 선단을 부착 권장한다. 소포 용액의 제조 유리 병을 청소하고, 절차 1.1.1.1에 소개 된 바와 같이, 유리 병에서 물을 제거합니다. 부드럽게 질소 가스를인가함으로써 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)의 2 mL의 부피를 건조하고 잔류 용매를 제거하기 위해 1 시간 동안 실온에서 유리 병을 건조하는. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. 2 추가바이알 내로 ml의 탈 이온수는 지질을 건조시키고, 1 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 바이알을 배양 함유. 유리 병 여러 번 흔들어하고, 초음파 처리 (HF 주파수 : 40 kHz에서, 전원까지 : 370 원) 소포를 얻기 위해 30 분. 단 분산 단일 층 소포를 얻기 위해 압출 및 동결 해동 과정을 수행합니다. 제조 소체 대한 상세한 프로토콜은 메이어 외. (21)에 대하여 설명한다. 주 : 액적 계면의 면압 단 분산 단층 소포를 포함하는 액체 방울을 형성 한 후에 대기 시간을 조절함으로써 정확하게 제어된다. 펜던트 드롭 방식 (22)을 이용하여, 사전에 실험을하고, 시간에 따른 면압의 변화를 측정하는 것이 필요하다. 곡면에 인지질 단층을 포함 액적 형성 procedur에서 탈 이온수 10 μL와 테이퍼 모세관를 입력전자 2.2.1. 대안 적 절차에서 2.2.2 소포 용액 10 μL를 사용한다. 방울을 형성하는 압력을 제공하기 위해 자동화 된 마이크로 인젝터 모세관 연결한다. 정확하게 모세관의 위치를​​ 제어하도록 미세 조작기에 마이크로 인젝터에 접속되어 모세관 마운트. CCD 카메라와 모세관의 측면도을 이미징 (10X 현미경 NA 0.3 1 대물​​ 렌즈)를 명 시야 현미경을 준비한다. 따라서 1 현미경 Z 축을 따라 적의 정확한 위치를 관찰하고 액 적의 크기를 추정 할 수있다. ~ 100 (적절한 크기까지 모세관의 선단과 변압 (~ 100 고전력 증폭기)을 선단의 측면도 잘 미세 조작기를 사용하는 현미경 (1)에 의해 가시화되는 위치에 선단부를 이동 적용 액적 지름 μm의)이 형성된다. 참고 : 자동화 된 마이크로 인젝터 및 미세 조작기를 사용하는 것이 좋습니다D는 방울의 크기와 위치의 정밀한 제어가 필요하고, 경우. 그것은 수동 것을 사용하는 것도 가능하다. 물방울 병합 후 3 이미징 형광 복구 주 :이 프로토콜의 기본 원리는 액적 유착 과정을 제외 FRAP 기술의 그것과 동일하다. FRAP의 상세한 프로토콜 및 관련 이론 A. 로페즈 등. (15)와 D 악셀로드 등. (16)에서 사용할 수 있습니다. 모니터링 및 액체 방울의 위치를​​ 제어 로다 민 – DPPEs (560 nm에서 여기, 583 nm에서 방출)에 대한 적절한 필터 세트와 형광 현미경을 모두 할 수 있습니다 (: 10 배 NA 0.3, 튜브 렌즈 초점 거리 17cm 현미경 2, 대물 렌즈)를 설정 거꾸로 현미경을 준비 및 명 시야 현미경. 형광 현미경으로 액적 m의 평면도를 시각화 여기 CCD 카메라를 사용하여송시와 밝은 필드 현미경 모드. Z 축을 따라 평면 공기 – 물 계면에 인지질로 피복 한 방울을 이동하지만, 미세 조작기를 이용하여, 아직 액체 방울을 병합하지 않는다. 방울의 측면보기를 시각화하는 현미경 1을 사용합니다. 미세 조작기를 사용하여 평면 단일 층의 평면도의 중심에 방울을 찾습니다. 평면 단일 층의 평면도를 시각화하는 현미경 2의 밝은 필드 현미경 모드를 사용합니다. 평면 공기 – 물 인터페이스에 방울을 병합 방울이 미세 조작기를 사용하여 인터페이스 상에 병합 될 때까지 평탄 계면을 향해 상기 액 적을 이동. 병합 프로세스가 성공적으로 수행 된 경우, 흰색 배경에 의해 둘러싸인 원형과 어두운 영역은 현미경 (2)의 형광 모드를 이용하여 관찰된다. 극소의 형광 모드를 사용하여, 액체 방울을 병합 한 후 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈를 녹화2. 여기서 단층의 확산 시간 스케일보다 더 빠른 프레임 레이트를 사용하여 극복. DOPC 단층에서 완전히 200 μm의 어두운 영역으로 확산하는 데 몇 분 정도 걸립니다. 4. 영상 분석에 의한 확산 계수 결정 주의 : 아래에 설명한 바와 같이 일련의 이미지에서의 확산 계수를 결정하기 위해 이미지 분석 용 맞춤 프로그램이 내장되어있다. 이 프로그램의 자세한 소스 코드 조브 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. 관심의 원형 영역의 검출 관심 영역의 중심 검출 원형 어두운 영역 및 백색 배경을 포함하는 복구 처리 중에 기록 된 형광 일련의 이미지를 획득하고, 참조 화상과 같은 시리즈의 첫 번째 이미지를 설정한다. 여기서, D는 R 기준 화상에서 어두운 영역의 반경이다. 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상 사람SE 강도가 전체 영역에 걸쳐 균일하다. 여기 맞춤형 프로그램 라인 (124)의 소스 코드와 같이 컨벌루션위한 'CONV2'라는 기능을 사용하여 매립, 흰색 원의 반경 R에 D보다 약간 작다. 컨볼 루션 연산에 최소치를 나타내는 위치를 찾아 내고, 기준 영상에서 관심 영역의 중심이 위치를 설정한다. 관심 영역의 반경을 결정 전체 영역에 걸쳐 균일 한 절차 4.1 강도에 의해 결정된 중심 위치를 포함 흰색 원과 참조 화상을 나선상. 여기서, S는 R 흰색 원의 반경이다. 이러한 반복 사용 '대'또는 사용자 정의 프로그램 라인 102-109의 소스 코드에 도시​​ 된 바와 같이 흰색 원을 만드는 원의 방정식 '하면서'등. 약간이 다른 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상R의 S보다 큰 반경 (5 % -10 %), R의 L,. 맞춤형 프로그램 라인 113-120의 소스 코드에 나타낸 바와 같이 동그라미를 만드는 절차 4.1.2.1과 동일한 방법을 사용한다. 4.1.2.1 및 4.1.2.2의 두 회선 계산 사이의 값의 차이를 가져옵니다. 화소 레벨로의 S와 R R L의 양을 증가시킴으로써, R S = 2R D에 R R S = D / 2에서 상술 한 과정을 반복한다. 반복 4.1.2.3에 절차 4.1.2.1에서 전체 소스 코드를 포함하는 반복합니다. 두 회선 계산 사이의 값의 최대 차이를 나타내는 R (S)의 반경을 찾을 수 있습니다. 이 R 따라서 참조 화상에서 어두운 영역의 반경을 나타내는 S (149)로 정의 프로그램 라인 (148)의 소스 코드와 같이 반경을 찾기 위해 맥스 '라는 용도 임베디드 함수의 값은 최대 차를 나타낸다. </리> 분수 강도의 계산 관심 영역으로서 4.1 절차에 의해 결정된 중심 위치 및 반경을 포함하는 원을 설정한다. 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈에서 관심 영역의 평균 강도를 계산한다. 관심의 영역과 각 프레임을 나선상 평균 강도를 계산하는 데 관심 영역의 면적을 나눕니다. 세부 사항은 주피터 웹 사이트에서 사용할 수있는 사용자 정의 프로그램의 소스 코드에서 사용할 수 있습니다. F (t)는 시간에 따라 관심 영역 인 원의 평균 강도는 다음 식으로 정의 부분의 강도를 계산, F i는 원의 초기 강도 및 F o를의 강도 흰색 배경. F (t) = (F (t) – F에서 I) / (O F – F에서 I) (식 1). F 피팅FRAP 이론 ractional 강도 I 1 피팅 프로그램을 사용하여, 베셀 함수를 수정, τ는 시간 확산 특성 및 I 0이고 다음 식으로 분별 강도를 맞춘 τ를 얻기 (수학 식 2). D는 확산 계수이고, 어두운 영역의 반경의 관계, τ에 기초하여 확산 계수 = 2 / 4 D를 얻었다. 주 : 피팅 과정은 복구 과정이 이미 화상을 기록하기 전에, 시작되면 시간축 분수 강도 프로파일을 이동시킬 수있다.