We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Los fosfolípidos son componentes principales de las membranas celulares y las membranas de las organelas, y la fluidez de estas capas de membrana a menudo afecta a las funciones celulares mediante la alteración de la actividad de proteínas de membrana 1 – 3. Por ejemplo, la membrana homeostasis de los lípidos se logra mediante la regulación de la fluidez de membrana, que se detecta por las proteínas de membrana, y un nivel anormal de fluidez causa enfermedades graves, como la esteatosis hepática y colestasis 4. Además, la fluidez de una monocapa de fosfolípidos en la interfase líquido-aire alvéolos tiene implicaciones importantes en sus funciones. De alta fluidez de la monocapa de fosfolípido tensioactivo pulmonar facilita la difusión de la capa durante la inhalación, mientras que una fluidez a baja permite que la capa de mantenerse dentro de los alvéolos durante la exhalación 5,6. Por tanto, es importante para estimar la fluidez de las capas de fosfolípidos para entender sus roles.
_content "> A medida directa de la fluidez es la viscosidad, y la viscosidad de las capas de fosfolípidos se ha medido mediante el uso de coloides de tamaño micrométrico 7, agujas magnéticas 8,9, y magnético micro-botones 6,10,11. Sin embargo, estas técnicas se limitan a películas relativamente rígidos, y no se puede medir películas menos viscosos. Para tales casos, la difusividad sería una alternativa para cuantificar la fluidez de las capas de fosfolípidos. Durante varias décadas, una variedad de técnicas para medir las propiedades de difusión de las capas de fosfolípidos se han desarrollado, tal como el método de fluorescencia de temple 12, gradiente de campo pulsado NMR 13, y la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) 14. Uno de los métodos más representativa es la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) 15,16. Debido a la simplicidad del procedimiento de medición y relacionados teorías, varios estudios sobre las propiedades de difusión de las capas de fosfolípidos se han realizado utilizando FRAP <sup> 17-19. Sin embargo, FRAP por lo general requiere una configuración de microscopio confocal caro con un láser de alta potencia.A continuación, presentamos una nueva técnica para medir la difusión lateral de monocapas de fosfolípidos, denominado como la recuperación de fluorescencia después de la fusión (FRAM). La diferencia clave entre FRAP y FRAM es que la etapa fotoblanqueo se sustituye por la coalescencia gota. La fusión de una gotita cubierto por monocapa no de fluorescencia en una monocapa plana marcada con fluorescencia deja una mancha oscura circular sobre una monocapa plana brillante, estableciendo así el mismo estado inicial con el paso fotoblanqueo. Luego observamos la recuperación de la fluorescencia en la mancha oscura con tiempo para medir la difusividad lateral. Este nuevo "blanqueo" paso a la coalescencia gota ofrece ventajas significativas sobre FRAP: FRAM sólo requiere un microscopio de fluorescencia en lugar de un microscopio confocal caro con un láser de alta potencia que es necesario para FRAP. yon Además, FRAM tiene una amplia selección de colorantes fluorescentes ya que no involucra el proceso fotoblanqueo. Finalmente, las dos monocapas diferentes, una monocapa de las gotitas y una monocapa plana, se pueden preparar de forma independiente, permitiendo así la interdifusión a medir, mientras que sólo el FRAP mide la auto-difusión de monocapas.
FRAM ofrece una amplia gama de mediciones de difusión de materiales altamente viscosos a materiales casi no viscosos. En principio, FRAM puede medir la difusividad máximo de 10 6 m 2 / seg, que es comparable a las técnicas existentes, cuando la difusión se produce a través del área 100 micras por 100 micras durante el tiempo para el proceso de coalescencia gota (~ 10 mseg). Además, el proceso de difusión lenta se puede medir fácilmente a menos monocapas son sólidos. FRAM se puede utilizar para cualquier tipo de materiales activos de superficie, siempre y cuando las moléculas etiquetadas con fluorescencia apropiados están disponibles.
FRAM comparte una gran cantidad de principios fundamentales con FRAP, especialmente para medir la recuperación de fluorescencia después de blanquear un área específica, pero FRAM utiliza un proceso de fusión de una gotita en la interfaz plana para formar una zona blanqueada, en lugar de aplicar una luz intensa. El proceso de fusión es, pues, el paso más importante en FRAM, y sobre todo, la forma de la mancha oscura en la monocapa plana después de la fusión de una gotita determina la exactitud de la medición de la difusividad. Específicamente, sobre la base de un método actual, sólo se establece el círculo con un radio R como una región de interés para calcular la intensidad media de la mancha oscura, que se muestra en el procedimiento 4, y si hay un exceso de desviación de la forma circular, esto podría perturbar la medición precisa de un coeficiente de difusión. Por lo tanto, es necesario para obtener una región oscura de forma circular, pero, formas no circulares se forman en ocasiones debido a varias razones. En primer lugar, si existe un flujo de convección en el Petplato ri, la forma de la zona oscura se alarga a lo largo de la dirección del flujo. Como se ha mencionado en el procedimiento 1.3, un aparato de cono en forma de ayuda a suprimir el flujo convectivo, y este alargamiento se reduce al mínimo. En segundo lugar, si el extremo de la punta del capilar toca la interfaz plana durante un proceso de fusión, el área oscura está formada con una variedad de formas desde el final capilar interrumpe el proceso de fusión. Con la obtención de una gotita que sólo cuelga desde el extremo del capilar, esta interrupción se puede prevenir. En particular, un tratamiento hidrofóbico del capilar ayuda a la gota para sentarse al final del capilar. Por lo tanto, los tiroteos de problemas anteriores y modificaciones nos permiten medir las propiedades de difusión con mayor precisión.
Así, este proceso bien localizado averías permite FRAM tener varias ventajas significativas sobre FRAP. En primer lugar, FRAM requiere un equipo sencillo que FRAP. Para FRAM, es suficiente para utilizar un simple micros de fluorescenciahacer frente, en lugar de un microscopio confocal caro con un láser de alta potencia cuya longitud de onda debe coincidir con el espectro de absorción del colorante. Además, es necesario utilizar un aparato adicional para ajustar el tamaño a la zona blanqueada en el FRAP, mientras que el FRAM controla el tamaño de la zona de fácil ajustando el tamaño de la gotita, o la presión superficial en la superficie de las gotitas. En segundo lugar, es posible utilizar varias especies de colorantes en FRAM. FRAP sólo utiliza moléculas de colorante cuyo proceso de blanqueo es mucho más rápido que el proceso de difusión. Si la difusión de los colorantes se produce durante el proceso de blanqueo, es difícil estimar con precisión la propiedad de difusión. El FRAM, sin embargo, no requiere un proceso para el blanqueo de colorantes y esto por lo tanto permite el uso de varios tipos de colorantes de la formación de imágenes de fluorescencia. Además, el FRAP requiere láseres de alta potencia y el filtro establece adicionales para cambiar la especie de colorante, mientras que sólo es necesario para reemplazar los conjuntos de filtros en el FRAM. Finalmente, Ya que las monocapas en la superficie de las gotitas y la interfaz plana se puede formar de manera independiente, lo que permite el estudio de la inter-difusión o la mezcla entre dos monocapas de lípidos diferentes mediante la fusión de A-tipo monocapa con el de tipo B monocapa, mientras que sólo el FRAP mide la auto-difusión de una monocapa.
A pesar de estas ventajas, el proceso de fusión de una gota sobre una interfase aire-agua plana potencialmente puede limitar esta técnica debido a varias cuestiones que podrían ser motivo de preocupación, como una falta de coincidencia presión superficial entre las dos monocapas, la escala de tiempo del proceso de fusión , y un aumento en la presión superficial de la monocapa plana después de la fusión de las gotitas. Estos problemas, sin embargo, no afectan a la medición de la difusión de manera significativa por las siguientes razones. En primer lugar, a pesar de las presiones de superficie en las dos monocapas diferentes son bastante diferentes, un proceso de equilibrado se completa en una etapa muy temprana durante el proceso de recuperación. Por ejemplo, si tque la superficie de presión de la monocapa en la superficie de las gotitas es mayor que la de la monocapa en la interfase aire-agua plana, el área oscura se expande hasta que la presión se equilibra superficie. Dado que este proceso se completa dentro de 10 mseg, la presión superficial se equilibró antes de que afecte el proceso de difusión de manera significativa. En segundo lugar, si la escala de tiempo del proceso de fusión es lo suficientemente rápido, no limita la medición de difusión en absoluto. Afortunadamente, un proceso de fusión típica también se completa en 10 ms. Por último, incluso la fusión de varias de las gotitas en la interfaz plana no aumentan la presión superficial ya que el área de la superficie de la cubeta es mucho más grande que el área de la superficie de la gotita. De acuerdo con los tamaños de la vaguada y las gotitas, que se describe en el protocolo, el área por molécula aumenta menos de 0,015% mediante la fusión de una gota. En consecuencia, el aumento de presión en la superficie debido al cambio de área por molécula es menor que 0,1%, que es negligible porque es mucho menor que el error típico de la presión superficial, medida por la placa de Wilhelmy tensiómetro.
En resumen, hemos introducido un nuevo método para medir la propiedad difusión lateral de una monocapa de fosfolípidos mediante la fusión de una monocapa de gotas en la interfaz plana. Esta técnica requiere un equipo relativamente simple y también permite el uso de varios tipos de especies de colorantes. El FRAM es por tanto, potencialmente aplicable para la medición de la difusión de cualquier agente de superficie activa, incluyendo los fosfolípidos, copolímeros de bloque, proteínas e incluso nanopartículas en una interfaz de fluido-fluido. Además, esperamos que el FRAM ofrece una nueva manera de estudiar la interrelación difusión o la mezcla entre dos agentes tensioactivos diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por el Proyecto financiado por el KAIST K-Valle RED & B para el 2014 y el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |