Мы описываем технику, чтобы маркировать нейроны и их процессы с помощью Антероградный или ретроградная трассирующих инъекций в ядрах головного мозга с использованием препарата в пробирке. Мы изменили существующий метод из п я пробирке трассирующими электропорации, воспользовавшись флуоресцентно меченного мутантов мыши и основную оптического оборудования с целью повышения точности маркировки.
Мы представляем технику, которая сочетает в себе пробирке протокол в трассирующими впрыска, которая использует серию электрических импульсов и давления, чтобы увеличить поглощение красителя через электропорации в мозг эксплантов с целевой лазерной подсветки и соответствующих фильтров очки во время процедуры. Описанная методика электропорации в пробирке по себе дает относительно хорошее визуальное управление для таргетинга определенные участки мозга. Объединив его с лазерным возбуждением люминесцентных генетических маркеров и их чтения через фильтр очки группы обход, который может забрать выбросов генетически меченых клеток / ядер и красителя трассировки флуоресцентного, исследователь может существенно повысить точность инъекций находя интересующую область и контроля за распространением красителя / поглощения в области инъекции гораздо более эффективно. Кроме того, этот метод лазерного излучения позволяет исследовать функциональные возможности данного neurocircuit по провiding информацию о типе нейронов, в определенной области в тех случаях, когда выражение GFP связана с типом передатчика, выраженного субпопуляции нейронов.
Для того, чтобы определить определенный нейронов (микро) схема, надо начать с поиска различных участников указанной схеме, и их способа подключения. С тех пор, публикация Уоллера о neurofiber трассировки через lesioning 1 большое разнообразие методов нейроанатомической трассировки был создан. Некоторые из этих методов может быть применен в фиксированной ткани вскрытии 2-4, другие полагаются на активном переносе красителя в живых нейронов, а обнаружен в 1971 5-6. Последнее может быть далее подразделены на две группы различения методов воспользовавшись активного ретроградный (от введенного области к источнику заданной проекцией, т.е.. В somata нейронов, которые проецируют на указанный участок) и активным антероградную (от вводят площадь к цели в данной проекции, то есть. аксонов прогнозов и аксонов терминалов меченых нейронов) транспорта. Кроме того, в некоторых случаях TRACER материал вводят в живых животных, которые затем пережить инъекции несколько дней или недель (в естественных условиях трассирующих инъекций), в то время как в других случаях вводят эксплантированных мозги и инкубировать в течение нескольких часов после инъекции в области искусственного спинномозговой жидкости (в пробирке трассирующими инъекции) ,
В этом протоколе мы изменили существующий в пробирке техники электропорации 7-8 маркировать нейронов somata и процессы в Антероградный и ретроградной трассировки экспериментов с использованием choleratoxin субъединицы-б и тетраметилродамин декстран как след веществ. Общая цель этого протокола состоит в обеспечении нейрофизиологов с эффективным инструментом, чтобы проследить закономерности нервных подключения между различными ядрами головного мозга, в то время как воспользовавшись доступных трансгенных линий мышей и основной оптического оборудования с целью повышения точности ориентации во трассирующих инъекций. Хотя метод Антероградный и ретроградной трассировки с помощьюcholeratoxin и декстран амин и их соответствующие флуоресцентно меченных конъюгатов не нова 9-13 (как это метод электропорации, например. Хаас и др. 14), сочетание индикаторных инъекций с электропорации в подготовке в пробирке с участием блоков ткани головного мозга является более недавнее развитие 7. Основное преимущество над методами нейронных трассировку и тот же тип меченых красителей в живых животных является увеличение интенсивности маркировки, из-за более высокой эффективности, с которой электропорации краситель быть занимаемого нейронов. Дополнительным преимуществом является укороченный инкубационный период (необходимое для транспортировки красителя) и его повышенная точность целевого во время инъекции трассирующей, потому что экспериментатор визуальный контроль над целевой области инъекции. Последнее также означает, что нет дороже стереотаксической оборудование не требуется, чтобы найти ядро или мозга сферу интересов.
Для дополнинально повысить адресности, мы воспользовались трансгенной линии мышей, которая выражает GFP в глицинергических субпопуляции нейронов 15 и основной оптического оборудования, состоящих из ручного лазерного указателя 405 нм фильтрации длины волны и соответствующий полосовой очки (450 – 700 нм). Таким образом, мы достигли значительного дальнейшего увеличения ориентации точность путем идентификации области инъекции через флуоресцентного сигнала и обеспечивая более тонкую способ управления для распространения красителя в зоне впрыска путем наблюдения за взаимодействием между сигналом коренного GFP и индикатором флуоресценции. Наша методика позволяет также раскрыть функциональность схеме вместе с его подключения путем выявления GFP-положительных тормозящих нейронов (или возбуждающих в других линий мышей), которые были заполнены с индикатора.
В целом, мы усиливается мощный инструмент Нейрологическая изучать Коннектом позвоночных мозг и оценки тон разные нейроанатомические особенности данной neurocircuit. С помощью трансгенных мышей наряду с недорогой и широко доступный оптического оборудования мы смогли значительно увеличить точность ориентации наших инъекций. Кроме того, трансгенные мыши, позволили нам определить тип прослеженных соединений, которые помогли раскрыть функциональность тормозного микросхемы в слуховой мозга.
Общая численность в пробирке индикаторного электропорации, в отличие от исследований в естественных условиях отслеживания, является то, что дает исследователям лучше доступ к области мозга интерес и, следовательно, не предполагает дорогостоящего стереотаксической (и часто …
The authors have nothing to disclose.
Поддерживается NIH / NIDCD R01 DC эксперименты 011582. визуализации были проведены в университете Колорадо Anschutz Medical Campus Расширенный световой микроскопии Ядра при частичной поддержке NIH / NCRR Колорадо аст номер гранта UL1 RR025780 и расстройств Скалистые горы Neurlogical Core Center Грант NIH P30NS048154. Д-р Саша дю Лак из Института Солка предоставил нам мышей GlyT2-GFP.
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
Potassium chloride | P9333 | ||
Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
Magnesium chloride | M2670 | ||
Calcium chloride | C5080 | ||
Glucose | G7528 | ||
Sodium bicarbonate | S6297 | ||
Ascorbic acid | A4544 | ||
Myo-inositol | I5125 | ||
Sodium pyruvate | P2256 | ||
Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
Agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
Perfusion setup | Custom-made | ||
Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |