我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 外 I既存の方法を変更しました。
私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。
特定の神経細胞(マイクロ)回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、(与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体)アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性(注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末)輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、( 生体内のトレーサー注射で )数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された(in vitroでのトレーサー注射を) 。
このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、( 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14)新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中(染料の輸送に必要)を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。
ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ(450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm)で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの(他のマウス系統または興奮)GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。
要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。
、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位(多くの場合、電気生理学)装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください(in vivoでのトレー?…
The authors have nothing to disclose.
NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
Potassium chloride | P9333 | ||
Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
Magnesium chloride | M2670 | ||
Calcium chloride | C5080 | ||
Glucose | G7528 | ||
Sodium bicarbonate | S6297 | ||
Ascorbic acid | A4544 | ||
Myo-inositol | I5125 | ||
Sodium pyruvate | P2256 | ||
Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
Agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
Perfusion setup | Custom-made | ||
Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |