Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.
Lesiones por compresión de la médula espinal murino son modelos animales valiosos para el estudio de la lesión de la médula espinal (SCI) y la terapia regenerativa vertebral. El fórceps modelo calibrado de lesión de compresión es un cómodo, de bajo costo, y el modelo animal muy reproducible para SCI. Se utilizó un par de fórceps modificados de acuerdo con el método publicado por Plemel et al. (2008) para comprimir lateralmente la médula espinal hasta una distancia de 0,35 mm. En este video, vamos a demostrar una laminectomía dorsal para exponer la médula espinal, seguido de compresión de la médula espinal con las pinzas modificados. En el video, también vamos a tratar temas relacionados con el cuidado de los animales de laboratorio parapléjicos. Este modelo de lesión produce ratones que exhiben deterioro en la sensación, así como deterioro de la función del miembro posterior del aparato locomotor. Además, este método de lesión produce aberraciones consistentes en la patología de la SCI, como se determina por métodos inmunohistoquímicos. Después de ver este videoeo, los espectadores deben ser capaces de determinar los suministros y métodos necesarios para la producción de SCI de diversos niveles de gravedad en el ratón para los estudios sobre SCI y / o tratamientos diseñados para mitigar el deterioro después de la lesión.
Los modelos animales de SCI son herramientas valiosas para evaluar la eficacia de paradigmas terapéuticos diseñados para mitigar los daños como consecuencia de un traumatismo en la médula espinal. Fuera de la necesidad experimental, estos modelos deben proporcionar déficits reproducibles en locomotora y los comportamientos sensoriales, ser ajustable para producir lesiones de diferente gravedad, y demuestran que la gravedad de la lesión se correlaciona con el grado de déficit neurológico observado. Hay tres tipos principales de SCI con distintas características de la lesión: transección, contusión, compresión y 1. Brevemente, una lesión en la transección es una laceración en la médula espinal, una lesión por contusión surge de una breve vigor, focal aplicada a la médula espinal dorsal, y una lesión de compresión se produce cuando se aplica una fuerza perjudicial a la médula espinal, y puede ser también referido como una lesión por aplastamiento 2.
Las lesiones completas transección son clínicamente poco común en los seres humanos 3, mientras que una contusiónd lesiones de compresión son más comunes. La lesión de compresión produce un resultado similar a lo que se encuentra en SCI humana causada por, por ejemplo, compresión del tumor u otras fuerzas de compresión perjudiciales, y se puede realizar utilizando un simple conjunto de herramientas. Contusiones y compresión son similares en que ambas son una fuerza de compresión y ambos tienen características patológicas similares, tales como la desorganización cytoarchitectonic, y evocan respuestas endógenas similares a las lesiones 1,4. El modelo de lesión por contusión por lo general se aplica esta fuerza a la médula espinal dorsal usando un aparato especial de una manera similar a los casos humanos de SCI resultantes de una impactación de la columna vertebral 2,5,6. En contraste, las lesiones de compresión pueden ser generados por una variedad de métodos de aplicación de la fuerza dorsalmente o lateralmente. Métodos de una lesión de compresión incluyen pinzas 7, clips de aneurisma calibrados 2, o la colocación de un peso directamente en la médula espinal 8. Una ventaja de laclips de aneurisma es que son capaces de proporcionar diferentes cantidades de fuerza 9. El método de la adición de pesos a la superficie dorsal de la médula espinal directamente 8 requiere que el peso a estar en su lugar durante 10 min, aumentando drásticamente la duración de la cirugía y que resulta en inconsistencias debido a la colocación del peso y el movimiento debido a la respiración de la animal. Debido al pequeño tamaño de los ratones, situando los animales en aparatos especializados diseñados para el uso en ratas, como impactadores para las lesiones de contusión, puede ser difícil o resultar en lesiones inconsistentes 7. Sin embargo, los ratones están disponibles en una amplia gama de cepas transgénicas, a diferencia de los animales más grandes tales como ratas o conejos que son muy útiles para la investigación SCI.
El método Plemel de utilizar fórceps calibrados para comprimir la médula espinal genera un SCI reproducible con un alto grado de correlación entre la gravedad de la lesión y el déficit neurológico 7. Este modelo SCI quirúrgico esgenerado usando un par de fórceps No. 5 Dumont modificados que tendrá lugar aparte a una distancia definida por cualquiera de epoxi de metal o de alguna otra obstrucción para impedir el cierre completo. Esta separación de ingeniería asegura que el fórceps será siempre cerca de una cierta anchura en múltiples cirugías y por diferentes usuarios. La ventaja del método Plemel es que los materiales para producir los fórceps calibrados se pueden comprar y ensamblados en el laboratorio sin necesidad de equipo especializado fácilmente. Estas pinzas pueden soportar múltiples rondas de tratamiento en autoclave y de esterilización, y la falta de un aparato separado, voluminosos agiliza cirugías.
En este vídeo se demuestra el uso quirúrgico de un par de fórceps calibrados en la médula espinal de ratón para generar una lesión de compresión. También abordamos preocupaciones únicas relacionadas con el cuidado de los animales de la médula espinal lesionada de laboratorio para mejorar su calidad de vida después de la operación y reducir la mortalidad.
La elección de un modelo de SCI es importante en el diseño de experimentos para determinar la eficacia de los tratamientos para los casos humanos de SCI. Tales experimentos requieren un modelo animal que es altamente reproducible para limitar la variabilidad que puede resultar en datos no concluyentes. También deben ser de relevancia clínica para evaluar con precisión la condición humana que están modelando. Para ello, la elección de una lesión de compresión o contundente sobre una transección es más clínicamente relevante 3. Sin embargo, impactadores y aparatos caída de peso para las lesiones de contusión requieren el uso de maquinaria costosa y complicada. En contraste, el fórceps modelo calibrado de SCI utiliza fórceps que son fáciles de montar a partir de materiales comunes de laboratorio modificado, y la cirugía requiere sólo un paso adicional después de una laminectomía dorsal estándar para exponer la médula espinal. Sin embargo, un inconveniente de la utilización de este método es que la fuerza de compresión se aplica siempre lateralmente en lugar de dorsalmente, comomás a menudo se ve en los casos clínicos humanos de SCI 9, y las lesiones de compresión generados utilizando el método afecta en mayor medida rostral caudal de tejido que los modelos contusión 1,2. Este modelo ha sido demostrado por los creadores de la técnica, y nosotros, para generar reproducible SCI 7,11, y es muy adecuado para el tamaño de los ratones. Además, este modelo de lesión permite que los animales sean evaluados después de tratamientos de cirugía y terapéuticos utilizando una multitud de pruebas de comportamiento, como el ratón Escala Basso para la locomoción y la prueba de pelo de Von Frey, para verificar que una cohorte de animales comparten la misma gravedad de la lesión y déficits neurológicos 7,11-13. Estas mismas técnicas también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de los tratamientos administrados a los animales durante los estudios de investigación, el cumplimiento de los criterios generales para modelos animales utilizados para evaluar las terapias para SCI 2,7.
El método de producción de la pinza calibradas para el modelo de lesión es simple y se puede lograr con una variedad de métodos diferentes. Hemos utilizado el método de espaciador 11, según lo publicado por Plemel 7, y también han modificado fórceps utilizando un pequeño tornillo, que no sólo proporciona un método más fácil para crear el dispositivo de compresión, sino que también permite versatilidad en el ajuste de la anchura de compresión final, de beneficiarse de los estudios comparativos. La gama de opciones en la creación de las pinzas es casi ilimitado, siempre que el espaciador (s) proporciona un medio estable de siempre el cierre de las pinzas a la misma distancia y puede resistir la esterilización en autoclave y de esterilización. Los métodos quirúrgicos descritos en este vídeo son altamente reproducibles en todos los usuarios, sin embargo, es necesario que tenerse cuidado al realizar la laminectomía y suturar el animal después de que el procedimiento se ha realizado de manera que la médula espinal no sufre ningún fuerzas de compresión adicionales que pueden aumentar la gravedad de la lesión y confundir futuros experimentos. </p>
Con el entrenamiento y la práctica adecuada, el fórceps modelo calibrado de lesión de compresión es muy adecuado para la realización de SCI en ratones que imitan los casos clínicos observados en los seres humanos 2,3,7. Debido a la facilidad de crear fórceps, producir ratones de diferentes grados de gravedad de la lesión se puede hacer fácilmente. Esto será de gran beneficio para la observación de los efectos genéticos sobre SCI de diferentes grados de severidad en ratones transgénicos, así como la evaluación de la eficacia de los trasplantes de células madre en ratones. La mayoría de los estudios en la literatura se han realizado en ratas debido a su tamaño, que generalmente hace que las cirugías más fácil de realizar. Sin embargo, el método publicado por Plemel et al. 7 y descrito por nosotros en este vídeo debería permitir SCI a realizar en ratones con gran facilidad y reproducibilidad.
The authors have nothing to disclose.
Funding for this work was provided by Shriners Hospitals and CIRM fellowships to AMC and AM. We would also like to acknowledge Plemel et al.7 for first designing and publishing the calibrated forceps model.
Name | Company | Catalog No. |
Isoflurane Machine | Smiths Medical PM, Inc | VCT302 |
Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical | NDC: 66794-013-25 |
Dissecting Scope | Seiler Precision Microscopes | SSI 202/402 |
Germinator-500 (tool sterilizer) | Thomas Scientific | 3885A20 |
Puralube (Eye Ointment) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
Scalpel Handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 |
Scalpel Blade (#11) | Fisher Scientific | 08-914B |
Retractor (Colibri ) | Fine Science Tools | 17000-03 |
Friedman Pearson Roungeur | Fine Science Tools | 16021-14 |
Vanna (Castroviejo) Scissors | Roboz | RS-5658 |
Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11029-14 |
Laminectomy Forceps (Dumont #2) | Fine Science Tools | 11223-20 |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 |
Staples (wound clips) | Reflex7 | 203-1000 |
Sutures | Henry Schein | 101-2636 |
Needles (30 G x ½) | BD Biomedical | 305106 |
Syringe (1 ml) | BD Biomedical | 309659 |
Baytril (enrofloxacin) | Bayer | NADA 140-913 |
Buprenex (buprenorphine) | Cardinal Health | NDC 12496-0757-1 |