Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

O epitélio olfativo do mouse na cavidade nasal compreende 6-10.000.000 neurônios olfatórios bipolares ^1. Cada neurônio olfativo escolhe um dos 1.200 genes de receptores olfativos para expressão. Detecção de odorantes inicia por ligação a um receptor olfactivo ^2, que, em seguida, activa adenilil ciclase do tipo III (ACIII) ³ através da proteína G específica olfactiva Gu _olf ⁴ odorante. O aumento resultando em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) abre uma cíclico (CNG), canal de cátions não seletivos levando a influxo de Ca ²⁺ e Na ^+, e, posteriormente, Ca ²⁺ fechado de nucleotídeo influxo leva à abertura de um Cl Ca ²⁺ ativado ^– canal ^5,6. O resultante exterior Cl ^– fluxo é facilitada por uma alta Cl intracelular ^– concentração mantida constante por Cl ^– absorção, provavelmente através de Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^– NKCC1 co-transportador, oCl ^– / HCO3 ^– trocador SLC4A1, e transportadores ainda a ser identificados talvez adicionais ^6-8.

Neurónios olfactivos bipolares têm axónios, não ramificados individuais que se projectam directamente para o bolbo olfactivo e um dendrito que se estende para a superfície do epitélio e termina como um compartimento especializado, o botão dendrítica. A partir deste botão, 10-30 cílios, que pode atingir um comprimento de até 50-60 mm, emanam no muco que cobre a superfície epitelial ^9. As proteínas da cascata de transdução de sinal canónico estão principalmente localizados na membrana destas cílios. O aumento da superfície do epitélio sensorial amplifica a capacidade de detectar odorantes. Devido à densidade de neurônios sensoriais, os cílios se estende desde maçanetas dendríticas vizinhos se misturam. Este entrelaçamento resulta numa mistura aleatória dos cílios de diferentes neurónios, que expressam diferentes tipos de receptores olfactivos, na superfície do epitélio. A célula de detecção ealocação ular de proteínas ciliares que estão presentes em apenas um subconjunto de neurônios sensoriais, portanto, difícil de criosecções. Além disso, a localização precisa de tais proteínas ao longo dos cílios é quase impossível, visto que criocortes são tipicamente mais fina do que o comprimento médio dos cílios.

Para ativar a investigação da ciliar localização de proteínas de membrana até agora descaracterizados em neurônios olfativos, otimizamos um en face preparação técnica que permite a análise detalhada de localização de proteínas em cílios. Resumidamente, o rato é sacrificado ea cabeça dividida perto da linha média. Cornetos nasais, e os ossos frontais são removidos para expor o septo. O septo com a parte olfativa do epitélio de revestimento é solto por cortar todas as conexões para a cavidade nasal. Depois de colocar o septo numa placa de petri cheia com solução de Ringer, o epitélio é descascada und transferido para uma lâmina de vidro revestido. Após uma breve FIXATion passo, os procedimentos imunocoloração pode ser realizada se a manipulação é o mais suave possível para evitar danos do tecido frágil. Nós demonstramos a resolução alcançável através da comparação da coloração de duas proteínas de membrana em diferentes cílios olfactiva em criocortes clássicos e na preparação cara en descrito.