Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

L'epitelio olfattivo mouse nella cavità nasale comprende 6-10.000.000 bipolari neuroni sensoriali olfattivi ^1. Ogni neurone olfattivo sceglie uno dei 1.200 geni recettore olfattivo per l'espressione. Rilevazione di odoranti inizia legandosi ad un recettore olfattivo ^2, che attiva ciclasi di tipo III (ACIII) ³ tramite l'olfatto specifica proteina G Gα _olf ⁴ odorizzante. L'aumento conseguente adenosina monofosfato ciclico (cAMP) apre una ciclica nucleotide-gated (CNG), canale cationico non selettivo che porta a afflusso di Ca ²⁺ e Na ^+, e successivamente Ca ²⁺ afflusso porta all'apertura di un Cl Ca ²⁺ attivato ^– Canale ^5,6. La risultante partenze Cl ^– flusso è facilitata da un elevato intracellulare Cl ^– concentrazione mantenuta costante Cl ^– captazione, probabilmente attraverso il Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^– cotransporter NKCC1, laCl ^– / HCO3 ^– scambiatore SLC4A1, e forse altri trasportatori ancora essere identificate ^6-8.

Neuroni olfattivi bipolari presentano singoli, assoni non ramificati che proiettano direttamente al bulbo olfattivo, e un dendrite che si estende alla superficie dell'epitelio e termina in un vano specializzata, la manopola dendritica. Da questa manopola, 10-30 cilia, che può raggiungere una lunghezza di fino a 50-60 micron, emanare nel muco che copre la superficie epiteliale ^9. Proteine ​​della canonica cascata di trasduzione del segnale sono localizzati prevalentemente nella membrana di questi cilia. La superficie sensoriale maggiore dell'epitelio amplifica la capacità di rilevare odoranti. A causa della densità di neuroni sensoriali, cilia estendentesi da manopole dendritiche vicini mescolano. Questa compenetrazione risultati in una miscela casuale di cilia da diversi neuroni, che esprimono diversi tipi di recettori olfattivi, sulla superficie dell'epitelio. La rilevazione e la cellaassegnazione lare di proteine ​​ciliari che sono presenti solo in un sottogruppo di neuroni sensoriali è quindi difficile in criosezioni. Inoltre, la localizzazione precisa di tali proteine ​​lungo la cilia è appena possibile, poiché criosezioni sono tipicamente più sottile rispetto alla lunghezza media delle ciglia.

Per attivare la ricerca di localizzazione ciliare di proteine ​​di membrana finora non caratterizzate in neuroni olfattivi, abbiamo ottimizzato una tecnica di preparazione volto en, che consente l'analisi dettagliata di localizzazione delle proteine ​​in cilia. In breve, il mouse è sacrificato e la testa spaccata in prossimità della linea mediana. Turbinati, nasali e ossa frontali vengono rimossi per esporre il setto. Il setto con la parte olfattiva dell'epitelio rivestimento viene allentata tagliando tutte le connessioni alla cavità nasale. Dopo aver messo il setto in una capsula di Petri riempita con la soluzione di Ringer, l'epitelio è staccata und trasferito ad un vetrino rivestito. A seguito di una breve fixation passo, le procedure di colorazione può essere eseguita se la gestione è più delicata possibile per evitare danni del tessuto fragile. Dimostriamo la risoluzione ottenibile confrontando la colorazione di due diverse proteine ​​di membrana in cilia olfattiva in criosezioni classici e nella preparazione en face descritto.