This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Apoplasten ist eine deutliche extrazellulären Raum in Pflanzengeweben, die außerhalb der Plasmamembran liegt, und enthält die Zellwand. Die apoplastischen Raum von Pflanzenblättern ist der Ort von mehreren wichtigen biologischen Prozessen wie Zellwandbildung, zelluläre Nährstoff- und Wasseraufnahme und Exportanlagen-Endophyten Interaktionen und Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Die Infiltration-Zentrifugationsverfahren wird auch eine robuste Technik für die Analyse der löslichen Apoplasten Zusammensetzung verschiedener Pflanzenspezies hergestellt. Das durch dieses Verfahren erhaltene Flüssigkeit wird häufig als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) bekannt. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Vakuuminfiltration und Zentrifugationsverfahren für AWF Extraktion aus Phaseolus vulgaris (Französisch Bohne) cv. Tendergreen Blätter. Die Grenzen dieses Verfahrens und der Optimierung des Protokolls für andere Pflanzenarten diskutiert. Wiederhergestellte AWF können in einer breiten Palette von Downstream experimen verwendet werdents, die die Zusammensetzung des Apoplasten charakterisieren sucht und wie er in Reaktion auf Pflanzenart und Genotyp, der Pflanzenentwicklung und den Umgebungsbedingungen ändert, oder um zu bestimmen, wie Mikroorganismen wachsen in Apoplasten Fluid und auf Veränderungen in der Zusammensetzung.
Die Anlage Apoplast ist die interzellulären Raum, die Pflanzenzellen umgibt. Dies ist ein dynamisches Umfeld, in dem viele Stoffwechsel- und Transportprozesse stattfinden. Das Hauptstrukturkomponente des Apoplasten ist die Zellwand, die zusammengebaut und durch Enzyme, strukturelle Proteine und Metaboliten im Apoplasten befindet modifiziert. Bei gesunden Pflanzenzellen Apoplasten wird im allgemeinen in einem sauren Zustand gehalten ermöglicht Aminosäuren, Zucker und anderen Nährstoffen aus den Apoplasten zum Zytoplasma von H + symport 1 eingeführt werden. Während Saccharose Verkehr, Saccharose bewegt sich von photosynthetischen Quellen durch den Apoplasten und in Phloem Gefäßsystem; Saccharose wird dann durch einen osmotischen Potential apoplastischen Invertasen Abspalten Saccharose in der Spüle Organe 2 gehalten transportiert. Zucker und andere Nährstoffe können auch nach oben transportiert werden und reichern sich in der Stomata Hohlräume durch die Transpirationsstrom 3.
"> Apoplasten stellt auch ein Umwelt Nische viele Krankheitserreger aufzubauen deren parasitäre Lifestyle. Bakterielle Pflanzenpathogene haben die Fähigkeit, hohe Dichten in den Apoplasten, das sie durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder durch Wunden 4 Zugriff zu vermehren. Die Konzentration der Aminosäure Säuren und andere Stickstoffverbindungen in Tomaten Apoplast gezeigt worden sind, aus, um den Nährstoffbedarf von Bakterien und Pilzen 5,6 unterstützt sein. Primäre Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Krankheitserreger auch im Apoplasten auftreten, nämlich die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch extrazelluläre Peroxidase . und Oxidasen und die Stärkung der Zellwand durch Vernetzung und Kallose Ablagerung 7. Die Pflanzenzellwand ist reich an sekundären Metaboliten mit antimikrobiellen Aktivitäten, die biochemische Natur dieser sekundären Metaboliten variiert zwischen den Arten 8.Als Ergebnis des oben erwähnened und andere Prozesse enthält Blatt apoplastischen Fluid eine Vielzahl von Proteinen, Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren, Sekundärmetaboliten, Metalle und andere Kationen (zum Beispiel Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Konzentrationen an gelösten Stoffen im Apoplasten der Triebe sind weitgehend durch das Gleichgewicht der Transportprozesse zwischen den Apoplasten und Xylem, Phloem und Zytoplasma 9 auftretenden gesteuert. Allerdings Stoffwechselreaktionen und mikrobielles Wachstum auch konsumieren oder produzieren apoplastischen gelöste Stoffe. Die Zusammensetzung des Apoplasten ist bekannt, dass zwischen Pflanzenarten und Genotypen und als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen, einschließlich Licht, Ernährung und biotische und abiotische Stressfaktoren 9 abweichen. Durch die Untersuchung der Zusammensetzung des Apoplasten und wie sie sich ändert, einschließlich Eigenschaften wie Redox und osmotische Potential, pH-Wert, Nährstoff / Metabolit Verfügbarkeit und enzymatischen Aktivitäten, kann man neue Erkenntnisse darüber, wie Pflanzen wieder gewinnenchen an ihre Umgebung. Verständnis oder die Charakterisierung der molekularen Veränderungen, die in den Apoplasten Lösung auftreten ist kompliziert, weil es eine räumlich strukturiert und dynamische Fach, in dem Metaboliten und / oder Ionen können flüchtige, transienten oder mit der Zellwand und Zellmembran assoziiert ist. Darüber hinaus werden verschiedene Analysetechniken erforderlich, um die Reihe von verschiedenen chemischen Typen abdecken.
Um die Zusammensetzung des löslichen Apoplasten zu studieren, muss Fluid üblicherweise aus dem Gewebe herausgezogen werden. Es gibt verschiedene Verfahren, um aus verschiedenen Geweben, einschließlich einer neu vorgeschlagenen Filterstreifenmethode 10 extrahieren Apoplast Flüssigkeit, aber die meisten etablierten Extraktionsverfahren für Blätter ist Infiltration-Zentrifugation. Diese Technik hat sich bereits 11-13 bewertet worden und 14 Lohaus et al. 2001 eine gründliche Prüfung der viele der technischen Parameter der Methode. Wie der Name, die Infiltration-centrifu implizierttions Technik ist ein zweistufiges Verfahren, die im wesentlichen um Ersatz des apoplastischen Luftraum mit einer wässrigen Flüssigkeit Infiltration, die mit dem nativen apoplastischen Flüssigkeit vermischt, gefolgt von der Gewinnung der Infiltration / apoplastischen Fluidgemisch durch sanfte Zentrifugation der Blätter. Da das wiedergewonnene Flüssigkeit wird verdünnt und nicht alle in den Apoplasten vorliegenden Verbindungen (siehe unten), enthält, wird diese Flüssigkeit allgemein als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) oder manchmal interzellulären Waschflüssigkeit, anstatt apoplastischen Fluid bekannt. Die Infiltrations Zentrifugationstechnik leicht skalierbar wodurch einzelne oder gepoolte AWF Proben ausreichender Lautstärke erzeugt und an eine Vielzahl von stromabwärts biochemischen und analytische Techniken (unterzogen werden, wie zB Protein-Elektrophorese, Messung der Enzymaktivität, NMR, viele Arten von Chromatographie und Massen Spektrometrie). Blatt AWF ist auch nützlich als Apoplasten imitiert Wachstumsmedium für die Untersuchung der Wechselwirkung von Pflanzen kolonisierenden Mikroorganismen with ihre Umgebung 5.
In der folgenden Protokolle beschreiben wir, wie die Infiltration-Zentrifugationstechnik mit Phaseolus vulgaris cv durchzuführen. Tendergreen Blätter, und geben einige Beispiele für Downstream-Analysen mit dem Fokus auf Metabolomics. Wichtig ist, dass Methoden zur Bewertung der Qualität der AWF werden zusammen mit Beratung zur Verfügung gestellt, das Verfahren für unterschiedliche Blattarten zu optimieren.
Optimierung der Pflanzengewebe Quelle
Biologische und technische Veränderung kann groß sein, wenn die Durchführung Apoplast Extraktionen, damit ein hoch standardisierten Workflow ist hilfreich, um Kontinuität über Experimente zu erhöhen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die Quelle von Pflanzengewebe standardisiert werden, einschließlich Blatttyp, Blattalter, Wachstum / Umweltbedingungen und der Tageszeit (Tabelle 1). Große Unterschiede gibt es in der Leichtigkeit, mit der verschiedene Blätter infiltriert und die AWF anschließend durch Zentrifugieren gewonnen; Diese Unterschiede sind mit Spaltöffnungen Nummer, Maschenweite und Mesophyll Widerstand 12,14 korreliert. Auch zwischen den verschiedenen Sorten von P. vulgaris gibt es große Unterschiede in der Leichtigkeit und dem Ertrag der AWF Extraktionsverfahren; zB Blättern der Tendergreen Vielfalt werden dabei zugänglicher AWF Extraktion mit dieser Methode als die kanadischen Wonder Sorte. InnerhalbP. vulgaris die ersten Laubblätter sind der größte und am leichtesten zu infiltrieren, so dass sie die offensichtliche Wahl für apoplastischen Extraktionen. Apoplastischen Luft und Wassermenge wurde gezeigt, dass mit Blattalter bei mehreren Spezies, was zu Unterschieden in AWF Extrahierbarkeit 12,14 variieren. In P. vulgaris, ältere Blätter werden wesentlich schwieriger zu infiltrieren und ergeben weniger AWF beim Zentrifugieren; daher wurden Blätter geerntet, wenn sie voll Expansion erreicht. Blätter, die schwer zu infiltrieren anschließend erfordern höhere Geschwindigkeiten Zentrifugation, um den AWF erholen. Man sollte daher verschiedene Blattarten und Sorten Bildschirm sorgfältig vor der Entscheidung über eine Gewebequelle für große AWF Extraktionen.
Pflanzenwachstumsbedingungen muss auch im Rahmen des Experiments so weit wie möglich vereinheitlicht werden. Die Verwendung von Kammern nicht bevorzugt, da sie ermöglichen konstante Luftfeuchtigkeit, Temperatur und light Intensität Regimenter beibehalten werden. Das Ernten der Blätter immer an der gleichen Tageszeit auftreten, da die Konzentrationen der Metaboliten, Enzyme etc. variieren während des Tageszyklus 14. Schließlich, um sicherzustellen, dass die Anlage verlässt alle ähnliche Turgordruck, sollten die Pflanzen bald vor (ca. 1 Stunde) der Ernte bewässert werden.
Optimierung der Blattunterwanderung und Zentrifugation
Unerwünschte zytoplasmatischen Kontamination der AWF durch partielle Zellyse eintreten werden, wenn die mechanische Belastung durch die Zellen auftritt, ist während der Infiltration oder Zentrifugationsschritte zu hoch. Daher sollte das Verfahren für eine gegebene Blatttyp ein optimierter Kompromiss zwischen der Maximierung Ausbeute und zur Minimierung zytoplasmatischen Kontamination der AWF sein. In allen Fällen sollte man den niedrigsten Zentrifugation Geschwindigkeit, mit der AWF gewonnen werden kann, um mögliche mechanische Zerstörung der Blattzellen zu vermeiden. Optimierung der centrifutionsGeschwindigkeit sollte empirisch für jede Blatttyp durch die Beobachtung der Zahl erholt und Apoplast Kontamination über einen Bereich von Zentrifugation Geschwindigkeiten bestimmt werden. Es wurde beobachtet, dass die Markerenzymaktivitäten, wie MDH, G6PDH und Glucose-Phosphat-Isomerase, bleiben, bis ein Schwellenwert Zentrifugalkraft überschritten wird, oberhalb derer diese Aktivitäten erhöhen schnell, vermutlich aufgrund zytoplasmatischen Leck 9,12,14 gering. Die Verwendung von Parafilm zur Unterstützung während der Zentrifugationsstufe, wie von Baker et al. 2012 11 angemerkt, kann die Wirksamkeit der AWF Extraktion zu verbessern und kann eine mechanische Beschädigung der durch übermäßige Faltung und Verdichtung verursacht Blattspreite minimieren. Weiterhin ist die Verwendung von Parafilm verbessert die Visualisierung des Blattes nach der Zentrifugation bei sollte das Blatt auf Beschädigungen und Vollständigkeit der AWF Extraktions untersuchen.
Nouchi 12 beschreiben die Optimierung der AWF Erholung von geschnittenen Reisblattstücke, die difficult zu infiltrieren und erfordern höhere Zentrifugiergeschwindigkeiten AWF wegen ihrer kleinen Stomata Öffnungen zu sammeln. Verbesserte Benetzung des Reisblattoberfläche, entweder durch Voreinweichen der Blätter in destilliertem Wasser oder die Zugabe eines Tensids zu der Tränkflüssigkeit, erleichtert das Infiltrationsverfahren. Eine höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit (6000 xg) wurde auch verwendet, während der Überwachung für Kontamination apoplastischen 12. Während Einzelblattstücke gibt es immer die Gefahr, daß cytoplasmatische Kontamination werden häufiger auch bei intensivem Waschen der Wundstellen; Schnitt Blätter sollte daher nur bei Bedarf verwendet werden.
Für viele Studien von destilliertem Wasser als Tränkflüssigkeit 11 verwendet wird. Jedoch können Verbindungen zur Tränkflüssigkeit wie Salze oder Puffer zugegeben werden, um die Extraktion bestimmter apoplastischen Verbindungen, insbesondere Proteinen, 13 zu verbessern. Lohaus 14 untersuchten die Wirkung der Ionenstärke und des osmotischen on die Zusammensetzung des zurückgewonnenen AWF und fanden sie zu vernachlässigen. Änderungen des pH der Infiltrationsmedium kann jedoch die AWF Zusammensetzung 14 beeinflussen.
Die richtige Handhabung und Lagerung der extrahierten apoplastischen Flüssigkeit ist wichtig. AWF ist gezeigt worden, um eine Fülle von Proteasen und anderen Enzymen 13,20 sowie flüchtige organische Verbindungen enthalten. Deshalb, um Veränderungen in der Zusammensetzung der AWF nach der Wiederherstellung ist es empfehlenswert, Proben auf Eis oder auf andere Weise bei -80 ° C gelagert zu halten reduzieren. Weiterhin sollte enzymatischen Assays AWF sobald wie möglich durchgeführt werden nach der Extraktion zu Enzyminaktivierung durch Proteolyse verlängerte Verdünnungs begrenzen oder Gefrieren-Auftauen.
Das Verfahren der Infiltration verdünnt das apoplastischen Fluid und es ist oft notwendig, das Ausmaß dieser Verdünnung zu bestimmen. Der Zentrifugationsschritt kann auch verdünnt das AWF mit Wasser aus intrazellulären Kompartimenten. Ein Verdünnungsfaktor mussed, um in vivo Apoplast chemischen Konzentrationen schätzen, wenn Messungen an AWF gemacht. Ein Verdünnungsfaktor ist es auch notwendig AWF wieder vollzählig konzentriert ein, wenn er als Apoplast imitiert Wachstumsmedium für Mikroben – so passend in vivo Metabolitkonzentrationen so genau wie möglich. Mehrere Variationen existiert auf dem in Schritt 4 zur Bestimmung der AWF Verdünnungsfaktor durch Messung der Verdünnung einer Markerverbindung zur Tränkflüssigkeit zugegeben beschriebenen Verfahrens. Für alle Verfahren der AWF Verdünnung Berechnung davon aus, dass die Infiltrationsflüssigkeit nicht merklich absorbiert oder durch die Blattzellen während der AWF Recovery-Prozess verdünnt. Diese Annahme wurde zuvor für die Infiltrationsschritt 14 überprüft, sondern für den Zentrifugationsschritt ungeprüft. Die Markerverbindung muss auch nicht absorbiert werden, transportiert oder geändert wird, während im Apoplasten. Indigokarmin ist die am weitesten verbreitete und gründlich von Farbstoffen verwendet, getestetfür AWF Verdünnung Berechnungen. Indigokarmin zeigt eine geringe Absorption zu Kationenaustauscherharz von isolierten Zellwände und wurde als geeignet für AWF Berechnungen in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum und Glycine max 11,21,22 sein. Doch in einigen Blatttypen, zum Beispiel Reis und Gurken, Indigokarmin schien nicht vollständig nach der Infiltration, die zu einer Unterschätzung der AWF Verdünnungsfaktor 12,21 führen würde wiederhergestellt werden. Das Fehlen von Rückgewinnungs Indigokarmin kann darauf zurückzuführen sein, ihre Anfälligkeit in Isatin Sulfonat von Superoxid 23, der bekanntlich in den Apoplasten hergestellt werden, insbesondere unter Stress 24 Spaltung. Spaltung Indigokarmin in Isatin sulfonat führt zu einem Verlust der Absorption bei 610 nm und einer Zunahme bei 245 nm zur Folge. Ob diese Reaktion in nennenswertem Umfang in den Apoplasten auftritt, oder ob diese Reaktion durch die Zugabe von Superoxid-Fänger zu Infiltrat gehemmt werdenIonenflüssigkeit wurde bisher nicht untersucht worden. Blaudextran wurde statt Indigokarmin zur Quantifizierung der AWF Verdünnungsfaktor in Reis eingesetzt Blätter 12, wenn ihre Stabilität und Erholung der AWF wurde nicht berichtet. Alternativ können radioaktiv markierte Verbindungen, wie [14 C] Sorbit oder anderen quantifizierbaren internen Standards anstelle von Farbstoffen und die Abnahme der Radioaktivität oder der Konzentration gemessen und verwendet, um den Verdünnungsfaktor in analoger Weise 11,14,25 Berechnung verwendet werden.
Grenzen der Technik
Ein paar Einschränkungen gibt es für die Infiltration-Zentrifugation AWF Isolierungsmethode. Erstens kann die Verdünnung des Apoplasten während der Infiltration eine Antwort von der Pflanze hervorzurufen. Wenn die umgebenden Blattzellen erkennen eine verminderte Konzentration für bestimmte Komponenten des apoplastischen Fluid können sie durch Ausscheidung weiteren Metaboliten Verzerrung der Auslegung Metabolitkonzentrationen reagieren. Ineine Beurteilung dieses Problems wurde festgestellt, dass weder die Zeit zwischen dem Eindringen und Zentrifugation noch moderate Unterschiede in der Ionenstärke der Tränkflüssigkeit beeinflußt die Zusammensetzung des extrahierten AWF 14,22. Daher werden alle Artefakte Apoplasten Verdünnung gedacht werden, um resultierende minimal sein.
Ein zweiter möglicher Nachteil ist, dass die Elution der AWF durch Zentrifugation nicht alle im Apoplasten mehreren Gründen vorhandenen Moleküle nicht erfassen. Einige Verbindungen, insbesondere Kationen und Proteine können dicht mit der negativ geladenen Zellwand assoziiert und nicht mit dem AWF 13 eluieren. Andere Moleküle, wie Proteine ist möglicherweise zu groß, um effizient aus den Apoplasten zu den Zentrifugiergeschwindigkeiten verwendet 14 eluieren. Reaktive Sauerstoffspezies sind eine wichtige Klasse von Verbindungen in den Apoplasten erzeugt, aber aufgrund der kurzlebigen Natur dieser Verbindungen, und nicht näher Anforderungen für ihre Herstellung, ihre prEsence ist nicht gut von AWF Extraktion eingefangen. Es ist nicht bekannt, wie genau AWF stellt die in vivo Zusammensetzung Apoplasten Fluid und dies kann zwischen Spezies variieren.
Mehrere Tests bestehen, um zytoplasmatische Kontamination festzustellen, obwohl keiner sind allgemein akzeptiert. Assays von überwiegend cytoplasmatischen Enzymen (zB G6PDH, Hexose-Phosphat-Isomerase, MDH) haben den Vorteil, dass sie leicht durchführen, kann aber nicht gut mit cytoplasmatischen Leck 14,18 korrelieren. Die Beurteilung der zytoplasmatischen Metaboliten (zB Hexose Phosphate, Chlorophyll) ist vielleicht bezeichnend, aber weniger gut untersucht 11. Dennoch können beide Arten von Assay nützlich für relative Quantifizierung apoplastischen Kontamination zwischen den Proben sein. Idealerweise sollten mehrere unabhängige Messungen verwendet werden, um die Integrität der AWF Probe validieren.
Zwar erkennt seine Grenzen, die Infiltration-centrifugatihier beschriebene Technik bleibt eine einfache und robuste Technik, die in der Studie der apoplastischen Proteine, primäre und sekundäre Metaboliten und anorganischen Ionen.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
razor blade | Fisher | 12-640 | |
60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
vacuum source | |||
5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
indigo carmine | Sigma | I8130 | |
microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
NADH | Roche | 10128023001 | |
MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
ribitol | Sigma | A5502 | |
methanol | Sigma | 650471 | |
chloroform | Sigma | 472476 | |
vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |