This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
אפופלסט הוא תא תאי שונה ברקמות צמח שנמצאת מחוץ לקרום הפלזמה וכולל את דופן התא. תא apoplastic שלי צמחים הוא האתר של מספר תהליכים הביולוגיים חשובים, כולל קיר תא היווצרות, חומרים מזינים סלולריים ספיגת מים ויצוא, אינטראקציות הצמח-endophyte ותגובות הגנה לפתוגנים. שיטת החדירה-צנטריפוגה היא מבוססת היטב כטכניקה חזקה לניתוח הרכב אפופלסט המסיס של מיני צמחים שונים. הנוזל המתקבל בשיטה זו ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF). הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת האבק וצנטריפוגה מותאמת להפקת AWF מvulgaris Phaseolus קורות חיים (שעועית הצרפתית). Tendergreen עלים. המגבלות של שיטה זו ואופטימיזציה של הפרוטוקול למיני צמחים אחרים הם דנו. התאוששתי ניתן להשתמש AWF במגוון רחב של experimen במורד הזרםts המבקש לאפיין את ההרכב של אפופלסט וכיצד הוא משתנה בתגובה למינים צמחים וגנוטיפ, התפתחות צמח ותנאים סביבתיים, או כדי לקבוע כיצד מיקרואורגניזמים לגדול באפופלסט נוזל ולהגיב לשינויים בהרכבו.
אפופלסט המפעל הוא החלל הבין-המקיף את תאי צמח. זוהי סביבה דינמית שבו תהליכים מטבוליים ותחבורה רבים יתקיימו. המרכיב המבני העיקרי של אפופלסט הוא קיר התא, שהתאסף ושונה על ידי אנזימים, חלבונים מבניים ומטבוליטים ממוקמים בתוך אפופלסט. בתאי צמח בריאים אפופלסט בדרך כלל נשמרים במצב חומצי המאפשר חומצות אמינו, סוכרים וחומרים מזינים אחרים כדי להיות מיובאים מאפופלסט אל הציטופלסמה על ידי H + symport 1. במהלך הובלת סוכרוז, מהלכי סוכרוז ממקורות פוטוסינתזה באמצעות אפופלסט וכלי דם להשיפה; סוכרוז מועבר לאחר מכן על ידי פוטנציאל האוסמוטי מתוחזק על ידי invertases apoplastic ביקוע סוכרוז באיברי הכיור 2. סוכרים וחומרים מזינים אחרים יכולים גם להיות מועברים כלפי מעלה ומצטברים בחללים הפיוניות דרך זרם דיות 3.
"> אפופלסט גם מייצג נישה סביבתית שבו פתוגנים רבים להקים אורח החיים טפיל שלהם. יש לי פתוגנים מפעל בקטריאלי היכולת להתרבות לצפיפויות גבוהות באפופלסט, שבו הם לגשת דרך פתחים טבעיים כגון הפיוניות או דרך פצעים 4. הריכוז של אמין חומצות ותרכובות חנקן אחרות בעגבניות אפופלסט הוכחו להיות מספיק כדי לתמוך בדרישות התזונתיות של חיידקים פתוגנים ופטריות 5,6. תגובות הגנה ראשוניות לפתוגנים חיידקים להתרחש גם באפופלסט, כלומר הייצור של מיני חמצן מגיבים על ידי peroxidases תאי . וoxidases וחיזוק דופן התא דרך cross-linking וcallose תצהיר 7 דופן תא הצמח עשירה במטבוליטים משתיים בפעילות אנטי-מיקרוביאלי; הטבע ביוכימיים של מטבוליטים משניים אלה משתנה בין מיני 8.כתוצאה מהאמור לעיל, מוזכרed ותהליכים אחרים, נוזל apoplastic עלה מכילים מגוון של חלבונים, סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו, מטבוליטים שניוניים, מתכות וקטיונים אחרים (למשל, Mg 2 +, K +, Na +, 2 + Ca, Fe 2/3 +). הריכוזים מומסים באפופלסט של יורה נשלטים במידה רבה על ידי האיזון של תהליכים המתרחשים בין תחבורת אפופלסט והעצה, והשיפה ציטופלסמה 9. עם זאת, תגובות מטבוליות והתפתחותם של חיידקים גם לצרוך או לייצר מומסים apoplastic. הרכב אפופלסט ידוע שונה בין מיני צמחים וגנוטיפים ובתגובה לשינויים בתנאים סביבתיים כולל אור, תזונה ויוטיים ולחצי אביוטי 9. על ידי לימוד בהרכב אפופלסט וכיצד הוא משתנה, כולל מאפיינים כגון חיזור ופוטנציאל האוסמוטי, pH, מזין / זמינות המטבוליט ופעילות האנזימטית, אחד יכול לקבל תובנות רומן לכיצד צמחים מחדשspond לסביבתם. הבנה או המאפיין את השינויים המולקולריים המתרחשים בפתרון אפופלסט מסובכת כי זה תא במרחב מובנה ודינמי שבו מטבוליטים ו / או יונים עשויים להיות תנודתי, חולפים או הקשורים לקיר התא וקרום פלזמה. יתר על כן, שיטות אנליטיות שונות נדרשות כדי לכסות את מגוון סוגים שונים כימיים של.
כדי לחקור את ההרכב של אפופלסט המסיס, נוזל בדרך כלל צריך להיות מופק מהרקמות. מספר שיטות קיימות כדי לחלץ אפופלסט נוזל מרקמות שונות, כולל שיטת רצועת מסנן מוצעת חדש 10, אבל שיטת החילוץ שהוקמה ביותר לעלים היא חדירה-צנטריפוגה. טכניקה זו הוערכה בעבר 11-13 וLohaus et al. 2,001 14 לספק בדיקה יסודית של רבים מפרמטרים הטכניים של השיטה. כפי שמשתמע מהשם, החדירה-centrifuטכניקת gation היא שיטת שני שלבים שבעצם כרוכה החלפת המרחב האווירי apoplastic עם נוזל המימי הסתננות, שמתערבב עם נוזל apoplastic הילידים, ואחרי התאוששות של החדירה / תערובת נוזלי apoplastic ידי צנטריפוגה העדינה של העלים. כנוזל התאושש מדולל ואינו מכיל את כל התרכובות הנמצאות באפופלסט (ראה להלן), נוזל זה ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF), או נוזל כביסה לפעמים אינטר, ולא נוזל apoplastic. טכניקת החדירה-צנטריפוגה היא להרחבה בקלות ומאפשר דגימות AWF יחידים או משולבות של נפח מספיק כדי להיות שנוצרו ונתונים למגוון רחב של טכניקות ביוכימיים ואנליטיות במורד הזרם (לדוגמא, אלקטרופורזה חלבון, מדידת פעילות אנזים, NMR, סוגים רבים של כרומטוגרפיה ומסה ספקטרומטריית). עלה AWF שימושי גם כאפופלסט מחקת מדיום גידול ללימוד האינטראקציה של שנינות חיידקים מפעל התישבותh סביבתם 5.
בפרוטוקולים הבאים אנו מתארים כיצד לבצע את טכניקת החדירה-צנטריפוגה באמצעות Phaseolus vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים, ולספק כמה דוגמאות לניתוחים במורד הזרם, עם דגש על metabolomics. חשוב לציין, שיטות להערכת האיכות של AWF מסופקות יחד עם עצות כדי לייעל את ההליך עבור סוגים שונים עלה.
אופטימיזציה של מקור רקמות הצמח
וריאציה ביולוגית וטכנית יכולה להיות גדולה בעת ביצוע אפופלסט עקירות, ובכך זרימת עבודה סטנדרטית מאוד מועילה להגדיל המשכיות בניסויים (איור 1). חשוב לציין, המקור של רקמות צמח חייב להיות אחיד, כולל טיפוס עלה, גיל עלה, צמיחה / תנאים סביבתיים ושעה ביום (טבלת 1). הבדלים גדולים קיימים בקלות שבה עלים שונים הסתננו וAWF התאושש לאחר מכן על ידי צנטריפוגה; הבדלים אלה מתואמים עם מספר הפיוניות, גודל צמצם והתנגדות mesophyll 12,14. גם בקרב זנים שונים של פ vulgaris יש הבדלים גדולים בקלות ובתשואה של הליך מיצוי AWF; לעלי דוגמא למגוון Tendergreen משמש כאן הם נוחים יותר למיצוי AWF שימוש בשיטה זו מוונדר הזן הקנדי. בתוךפ vulgaris העלים האמיתיים הראשונים הם הגדולים ביותר והקלה ביותר לחדור, מה שהופך אותם הבחירה הברורה עבור עקירות apoplastic. Apoplastic האוויר ומים בנפח הוכח להשתנות עם גיל עלה בכמה מינים שמובילות להבדלים בextractability AWF 12,14. בפ vulgaris, העלים מבוגרים הפכו באופן משמעותי יותר קשה לחדור ותניב פחות AWF על צנטריפוגה; לכן עלים נקצרו כאשר הם הגיעו לרחבה מלאה. עלים שקשה לחדור לאחר מכן דורשים מהירויות גבוהות יותר צנטריפוגה להתאושש AWF. אחד ולכן צריך להקרין כמה סוגי עלים שונים וזנים בזהירות לפני שתחליט על מקור רקמה לעקירות AWF בקנה מידה גדולה.
תנאי גידול צמחים גם חייבים להיות אחידים ככל האפשר במסגרת הניסוי. השימוש בארונות צמיחה עדיף מאחר שהם מאפשרים לחות עולה בקנה אחד, טמפרטורה וניהול תאורהגדודי עוצמת t להישמר. הקציר של עלים תמיד צריך להתרחש באותו הזמן של יום, כי הריכוזים של מטבוליטים, אנזימים, וכו 'משתנים לאורך המחזור 14 היומי. לבסוף, על מנת להבטיח כי המפעל משאיר לכולם יש לחץ turgor דומה, צריכים להשקות את הצמחים לפני זמן קצר (~ שעה 1) הקציר.
אופטימיזציה של חדירת העלה וצנטריפוגה
זיהום cytoplasmic לא רצוי של AWF בשל תמוגה תא חלקית יגרום אם הלחץ המכני שבם נתקל התאים גבוה מדי במהלך שלבי חדירה או צנטריפוגה. לכן, את ההליך לסוג עלה נתון צריך להיות trade-off בין מותאם למקסם את התשואה ולהקטין את זיהום cytoplasmic של AWF. בכל המקרים, יש להשתמש במהירות צנטריפוגה הנמוכה ביותר בה ניתן לשחזר AWF כדי למנוע הפרעה מכאנית אפשרית של תאי העלה. אופטימיזציה של centrifuמהירות gation צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל סוג עלה ידי ניטור הנפח התאושש ואפופלסט זיהום על פני טווח של מהירויות צנטריפוגה. זה נצפה כי פעילות אנזים סמן, כגון MDH, G6PDH ואיזומראז גלוקוז-פוספט, יישאר נמוך עד כוח צנטריפוגלי סף היא עלתה, ומעליו הפעילויות אלה יגדלו במהירות, ככל הנראה עקב דליפת cytoplasmic 9,12,14. השימוש בParafilm לתמיכה במהלך שלב צנטריפוגה, כפי שציין בייקר et al. 2012 11, יכול לשפר את היעילות של מיצוי AWF ועשוי למזער את הנזק מכאני ללהב העלה שנגרם על ידי קיפול ודחיסה מוגזמים. יתר על כן, השימוש בParafilm משפר הדמיה של העלה לאחר צנטריפוגה כאשר יש לבחון את העלה לנזק ושלמות של חילוץ AWF.
12 Nouchi לתאר אופטימיזציה של התאוששות AWF מחלקי עלה אורז קיצוץ, שהם דifficult לחדור ודורש מהירויות צנטריפוגה גבוהות כדי לאסוף AWF בגלל הפתחים הפיוניות הקטנים שלהם. השתפר הרטבה של פני השטח העלה האורז, או על ידי presoaking את העלים במים מזוקקים או התוספת של חומרים פעילי שטח לנוזל ההסתננות, אפשר את תהליך החדירה. מהירות גבוהה יותר צנטריפוגה (6000 XG) שימשה גם תוך ניטור לזיהום apoplastic 12. בעת שימוש בחלקי עלה לחתוך תמיד יש את הסיכון שזיהום cytoplasmic יהיה נפוץ יותר אפילו עם כביסה נרחבת של אתרי הפצע; ולכן צריכים לשמש רק עלים לחתוך במידת צורך.
למחקרים רבים במים מזוקקים משמש כנוזל הסתננות 11. עם זאת, תרכובות ניתן להוסיף הנוזל החדירה, כגון מלחים או מאגרים, על מנת לשפר את המיצוי של תרכובות apoplastic מסוימות, במיוחד חלבונים 13. 14 Lohaus העריך את ההשפעה של כוח יוני והאוסמוטי on הרכב AWF התאושש ומצא אותם להיות זניח. שינויים ב- pH של מדיום ההסתננות, לעומת זאת, עשויים להשפיע על הרכב AWF 14.
טיפול ואחסון נכון של נוזל apoplastic חילוץ הוא חשוב. AWF הוכח מכיל שפע של פרוטאזות ואנזימים אחרים 13,20, כמו גם תרכובות אורגניות נדיפות. לכן, כדי להפחית את השינויים בהרכב של AWF לאחר ההחלמה מומלץ לשמור על דגימות קרח או מאוחסן אחר ב -80 ° C. יתר על כן, מבחני האנזימטית של AWF צריכים להתבצע בהקדם האפשרי לאחר החילוץ להגביל איון אנזים בשל proteolysis, דילול ממושך או להקפיא הפשרה.
התהליך של חדירה מדלל את נוזל apoplastic וזה לעתים קרובות יש צורך לקבוע את מידת דילול זה. צעד צנטריפוגה יכול גם לדלל את AWF עם מים מתאים תאיים. גורם לדילול הוא זקוקed להעריך in vivo אפופלסט ריכוזים כימיים כאשר מדידות נערכת בAWF. גורם לדילול נחוץ גם להתרכז AWF חזרה לכוח מלא כאשר הוא בשימוש כאפופלסט מחקת מדיום גידול לחיידקים – ובכך התאמה בריכוזי המטבוליט vivo בצורה מדויקת ככל האפשר. כמה וריאציות קיימות בשיטה המתוארת בשלב 4 לקביעת הגורם לדילול AWF על ידי מדידת הדילול של מתחם סמן נוסף לנוזל ההסתננות. לכל שיטות חישוב דילול AWF מניח שנוזל החדירה לא ניכר נספג או מדולל על ידי תאי העלה במהלך תהליך ההחלמה AWF. הנחה זו אומתה בעבר לצעד הסתננות 14 אבל הוא לא מאומתת לצעד צנטריפוגה. מתחם הסמן חייב גם לא ייקלט, מועבר או שונה ואילו באפופלסט. ארגמן Indigo הוא נפוץ ביותר ונבדק ביסודיות של צבעים בשימושלחישובי דילול AWF. ארגמן Indigo מציג הספיגה נמוכה לשרף חילוף קטיון וקירות תא מבודדים והוצג להיות מתאים לחישובי AWF בnapus Brassica, Pisum sativum, Solanum lycopersicum וגליצין מקסימום 11,21,22. עם זאת, בכמה סוגי עלים, למשל, אורז ומלפפון, ארגמן אינדיגו הופיע לא התאושש באופן מלא לאחר חדירה, מה שיוביל להערכה חסרה של הגורם לדילול AWF 12,21. חוסר ההתאוששות של ארגמן אינדיגו יכול להיות בגלל הרגישות שלו למחשוף לsulfonate isatin ידי סופראוקסיד 23, אשר ידוע להיות מיוצר באפופלסט, במיוחד תחת לחץ 24. מחשוף של ארגמן אינדיגו לsulfonate isatin יגרום להפסד של 610 ננומטר הספיגה ב ועלייה ב 245 ננומטר. אם תגובה זו מתרחשת למידה ניכרת באפופלסט, או אם תגובה זו יכולה להיות מעוכבת על ידי התוספת של אוכלי נבלות סופראוקסיד לinfiltratיון נוזל לא נחקר עד כה. dextran הכחול כבר בשימוש במקום ארגמן אינדיגו לכימות של הגורם לדילול AWF באורז משאיר 12, אם כי לא דווחו על יציבותה והתאוששות בAWF. לחלופין, ניתן להשתמש בתרכובות radiolabelled כגון סורביטול [14 C] או סטנדרטים פנימיים לכימות אחרות במקום צבעים והירידה ברדיואקטיביות או ריכוז שנמדד ומשמש לחישוב הגורם לדילול בדרך דומה 11,14,25.
מגבלות של הטכניקה
כמה אזהרות קיימות לשיטת בידוד AWF ההסתננות-צנטריפוגה. ראשית, הדילול של אפופלסט במהלך החדירה עלול לעורר תגובה מהמפעל. אם תאי העלה סביב לזהות ריכוז מופחת עבור רכיבים מסוימים של נוזל apoplastic, הם עשויים להגיב במפרישים מטבוליטים נוספים, מעוותים את הפרשנות של ריכוזי המטבוליט. בהערכה של בעיה זו זה היה ציין כי לא הזמן ובין החדירה וצנטריפוגה ולא הבדלים מתונים בחוזק היוני של נוזל החדירה השפיע על הרכב של AWF חילוץ 14,22. לכן, כל חפצים וכתוצאה מאפופלסט דילול הם חשבו להיות מינימאליים.
חסרון שני הוא שפוטנציאל elution של AWF ידי צנטריפוגה לא ללכוד את כל המולקולות הנמצאות באפופלסט מכמה סיבות. תרכובות מסוימות, בקטיונים וחלבונים מסוימים עשויות להיות קשורים באופן הדוק עם דופן תא מטען השלילי ולא elute עם AWF 13. מולקולות אחרות כגון חלבונים עשויות להיות גדולות מדי לelute ביעילות מתוך אפופלסט במהירויות צנטריפוגה משמשות 14. מיני חמצן תגובתי הם מעמד חשוב של מתחם מיוצר באפופלסט, אבל בשל האופי קצר מועד של תרכובות אלה, ודרישות שלא פורטו לייצור שלהם, יחסי הציבור שלהםesence לא נתפס היטב על ידי מיצוי AWF. זה לא ידוע כמה במדויק AWF מייצג את הרכב בvivo של נוזל אפופלסט ועשוי להשתנות בין מינים.
כמה מבחני קיימים כדי לקבוע זיהום cytoplasmic, למרות שאף אחד מתקבל באופן אוניוורסלי. מבחני של אנזימים בעיקר cytoplasmic (למשל, G6PDH, איזומראז פוספט hexose, MDH) יש את היתרון של להיות קל לביצוע אבל לא יכול לתאם גם עם דליפת cytoplasmic 14,18. ההערכה של מטבוליטים cytoplasmic (למשל, פוספטים hexose, כלורופיל) היא אולי מעיד יותר אך פחות הוקמה 11 גם. עם זאת, גם סוג של assay יכול להיות שימושי עבור כימות יחסי של זיהום apoplastic בין דגימות. באופן אידיאלי, יש להשתמש במדידות עצמאיות רבות כדי לאמת את שלמות מדגם AWF.
תוך ההכרה במגבלותיו, החדירה-centrifugatiבטכניקה המתוארת כאן נשאר טכניקה פשוטה וחזקה בחקר חלבוני apoplastic, מטבוליטים ראשוניים ומשניים ויונים אורגניים.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
razor blade | Fisher | 12-640 | |
60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
vacuum source | |||
5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
indigo carmine | Sigma | I8130 | |
microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
NADH | Roche | 10128023001 | |
MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
ribitol | Sigma | A5502 | |
methanol | Sigma | 650471 | |
chloroform | Sigma | 472476 | |
vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |