Özet

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

Published: July 31, 2013
doi:

Özet

La stimulation du nerf infrarouge a été proposé comme alternative à une stimulation électrique dans une gamme de types nerveuses, y compris ceux qui sont associés avec le système auditif. Ce protocole décrit une méthode de patch-clamp pour l'étude du mécanisme de la stimulation du nerf infrarouge dans une culture de neurones auditifs primaires.

Abstract

Il a été démontré ces dernières années que la lumière laser pulsée, infrarouge peut être utilisé pour obtenir des réponses électriques dans le tissu neural, indépendante de toute autre modification du tissu cible. Stimulation neurale infrarouge a été rapporté dans une variété de tissu nerveux périphérique et sensorielle in vivo, avec un intérêt particulier représenté sur la stimulation de neurones dans le nerf auditif. Cependant, alors que l'INS a été montré à travailler dans ces milieux, le mécanisme (ou mécanismes) par lequel la lumière infrarouge provoque une excitation neuronale n'est actuellement pas bien compris. Le protocole présenté ici décrit une méthode de patch-clamp de la cellule entière conçue pour faciliter l'enquête de stimulation neurale infrarouge dans des cultures de neurones auditifs primaires. En caractérisant parfaitement la réponse de ces cellules à illumination laser infrarouge in vitro dans des conditions contrôlées, il peut être possible d'obtenir une meilleure compréhension de la physica fondamentalel et processus biochimiques sous-jacents stimulation neurale infrarouge.

Introduction

Les domaines de la neurophysiologie et la bionique s'appuient fortement sur les techniques qui permettent une stimulation contrôlable des réponses électriques dans le tissu neural. Alors que la stimulation électrique reste l'étalon-or en excitation nerveuse, elle souffre d'un certain nombre d'inconvénients tels que la présence d'artefacts de stimulation lors de l'enregistrement des réponses neuronales, et un manque de spécificité de la stimulation due à la propagation du courant dans les tissus environnants 1.

Les deux dernières décennies ont vu le développement des techniques de stimulation optiquement médiation 2. Plusieurs de ces techniques nécessitent la modification du tissu cible, soit par l'ajout d'une molécule particulière (molécules par exemple en cage) 3 ou une certaine forme de manipulation génétique (par exemple optogenetics) 4, qui ne sont faciles à appliquer en dehors d'un contexte de recherche. Un intérêt particulier est donc stimulation neurale infrarouge (INS), wherebY tissu neural est excité par une lumière laser infrarouge pulsé. INS a le potentiel pour surmonter bon nombre des lacunes de la stimulation électrique en permettant, stimulation sans contact très spécifique du tissu neural 2. Cependant, alors que l'INS a été démontrée avec succès dans une variété de paramètres in vivo, le mécanisme précis de l'excitation reste incertain.

Quelques publications récentes ont montré les progrès vers la découverte du mécanisme derrière INS 5-7. Chauffage rapide due à l'absorption de la lumière laser par l'eau semble jouer un rôle clé. Cependant, au-delà de ce consensus n'a pas encore été atteint. Shapiro et al. 7 proposer un mécanisme très général selon lequel le chauffage rapide provoque une perturbation de la distribution des particules chargées adjacentes à la membrane de la cellule, ce qui conduit à un changement de la capacitance de la membrane cellulaire et la dépolarisation ultérieure. En outre, Albert et al. 5 affirment que laser chauffage induite active une classe spécifique de température des canaux ioniques sensibles (récepteur transitoire des canaux vanilloïde potentiels), ce qui permet aux ions de passer à travers la membrane cellulaire. A ce stade, il est difficile de savoir comment ces mécanismes se combinent, ou bien si il ya d'autres facteurs qui n'ont pas encore été identifiés.

Bien qu'un petit nombre de publications (références 5,7-9) ont étudié INS in vitro, la grande majorité des travaux publiés dans ce domaine a été réalisée in vivo (par exemple, les références 1,6,10-18). Stimulation infrarouge de neurones auditifs a été un domaine d'intérêt particulier, en raison des applications potentielles dans les implants cochléaires 10,14-18. Bien que des expériences in vivo sont importantes pour vérifier l'efficacité de la technique dans divers milieux, l'augmentation du niveau de contrôle offert par des études in vitro devrait conduire à une compréhension plus détaillée de la mécaniquenisme responsable de l'INS. Ce rapport décrit la préparation de cultures de neurones du ganglion spiral pour les enquêtes de patch-clamp, car ils peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes fondamentaux tout en reliant à la grande quantité de données existantes du système auditif.

La technique de patch-clamp est un excellent outil pour les enquêtes sur les phénomènes électrophysiologiques, en fournissant un moyen d'enregistrer l'activité électrique des cellules individuelles et d'étudier la contribution des courants sous-jacents individuels 19. Lorsque cette technique est appliquée à une écurie préparation in vitro de neurones primaires, telles que les neurones du ganglion spiral culture, il offre la possibilité d'étudier en profondeur les mécanismes par lesquels l'activité neuronale est contrôlée et manipulée.

Les protocoles définis dans cette oeuvre les méthodes de contour pour étudier l'effet de la stimulation laser sur les propriétés électriques des neurones du ganglion spiral par patch clampenregistrements. L'approche est basée sur un laser à fibre couplée au lieu d'un laser en espace libre, ce qui permet le fonctionnement sûr et plus facile et plus reproductible alignement sans avoir à modifier la configuration du microscope standard. Sur la base de ces protocoles, il devrait être possible de procéder à un large éventail d'expériences afin de déterminer plus clairement le ou les mécanismes derrière INS.

Protocol

1. Culture des neurones du ganglion spiral Stériliser petit tour (par exemple 10 mm de diamètre) des lamelles de verre et pinces courbes dans un autoclave. Transférer les lamelles stérilisés dans des puits individuels d'un 4 anneaux 35 mm boîte de Pétri stérile ou plaque 4 puits, à l'aide des pinces stérilisées. Appliquer 150 pi de poly-L-ornithine (500 pg / ml) et la laminine de souris (0,01 mg / ml) à la surface supérieure de la lamelle et la placer dans un incubateur (37 ° C)…

Representative Results

des neurones du ganglion spiral réagissent à une illumination laser avec répétable formes d'onde en tant voltage-clamp et des configurations d'enregistrement courant-clamp. figure 3a montre l'évolution typique de la circulation du courant à travers une membrane cellulaire en réponse à un 2,5 ms, 0,8 mJ impulsion laser (réponse moyenne à partir de 6 impulsions laser, répétée à intervalle de 1 sec) avec le potentiel de membrane maintenue à -70 mV, -60 mV et -50 mV. Courants entr…

Discussion

En utilisant les protocoles décrits dans le présent document, il est possible d'extraire et de la culture des neurones du ganglion spiral et d'enquêter sur l'activité électrique au laser évoqué en effectuant ensemble des expériences de patch-clamp de la cellule. Lorsqu'ils sont utilisés in vitro, la technique de patch-clamp offre un niveau de contrôle sur les paramètres expérimentaux qui n'est pas réalisable in vivo. les paramètres de stimulation de laser tels que la l…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Conseil australien de la recherche sous Linkage subvention projet LP120100264.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Yorumlar
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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