Özet

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Published: July 23, 2012
doi:

Özet

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Abstract

Microglia sono cellule della linea mieloide che risiedono nel sistema nervoso centrale (CNS) 1. Queste cellule hanno un ruolo importante in patologie di molte malattie associate neuroinfiammatoria come la sclerosi multipla (MS) 2. Microglia nel sistema nervoso centrale di un normale esprimere macrofagi CD11b marcatore e mostrano un fenotipo di riposo da esprimere bassi livelli di marker di attivazione quali CD45. Durante gli eventi patologici del sistema nervoso centrale, microglia si attivano come determinato dal upregulation di CD45 e di altri marcatori 3. I fattori che influenzano il fenotipo e le funzioni di microglia nel sistema nervoso centrale non sono ben studiati. I microRNA (miRNA) sono una famiglia crescente di molecole conservate (circa 22 nucleotidi) che sono coinvolte in molti processi fisiologici come la crescita e la differenziazione cellulare 4 e patologie come l'infiammazione 5. MicroRNA downregulate l'espressione di geni bersaglio determinati legame sequenze complementari dimRNA ir e svolgono un ruolo importante nella attivazione di cellule immunitarie innate tra macrofagi e microglia 6 7. Al fine di indagare miRNA-mediate percorsi che definiscono la microglia fenotipo, funzione biologica, e per distinguere microglia da altri tipi di macrofagi, è importante per valutare quantitativamente l'espressione dei microRNA in particolari sottogruppi distinti del SNC residente microglia. Metodi comuni per misurare l'espressione dei miRNA nel SNC includono quantitativa PCR da intero tessuto neuronale e ibridazione in situ. Tuttavia, quantitativa PCR da omogenato tissutale intero non consente la valutazione dell'espressione di miRNA in microglia, che rappresentano solo 5-15% delle cellule del tessuto neuronale. Ibridazione in situ permette di valutare l'espressione di microRNA in specifici tipi cellulari nelle sezioni di tessuto, ma questo metodo non è del tutto quantitativa. In questo rapporto descriviamo una quantitativa e sensitive metodo per la rilevazione di miRNA dal real-time PCR in microglia isolato dal sistema nervoso centrale normali o durante neuroinfiammazione con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di sclerosi multipla. Il metodo descritto sarà utile per misurare il livello di espressione dei microRNA in cellule microgliali in CNS normali o durante neuroinfiammazione associato a varie patologie tra cui sclerosi multipla, ictus, lesioni traumatiche, morbo di Alzheimer e tumori cerebrali.

Protocol

1. Isolamento della microglia dal CNS normali Isolamento di microglia viene eseguita come descritto in precedenza con modifiche 3. Preparare strumenti per la dissezione e la perfusione: forbici, pinze, siringa da 10 ml con ago 27g, 15 ml Dounce omogeneizzatore (Teflon / vetro), nylon 40 micron filtro cellulare, il 40% e 70% soluzioni di Percoll, 1X PBS. Euthanize topi per asfissia rapido (privazione di ossigeno) in CO 2 fotocamera e immediatamente t…

Discussion

Recentemente notevole interesse è stato dato a microglia e il coinvolgimento di queste cellule in molte patologie associate neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Inoltre, il ruolo dei microRNA nella differenziazione delle cellule immunitarie e cancro è drammaticamente cresciuta negli ultimi anni diversi 5,10. Abbiamo precedentemente riportato il ruolo di miR-124 nel mantenimento del fenotipo non attivata o di riposo della microglia nel CNS normali 7, ma il ruolo degli altri tipi di microRNA ne…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato supportato dal NIH R01 NS071039-01A1 assegno di ricerca.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Yorumlar
1X PBS GIBCO 14190 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS Thermo Scientific SH30258.02 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS GBCO 11965; 10438  
miRVana kit Invitrogen AM1561  
Percoll Sigma P4937-500 ml 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM
50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide AnaSpec Inc 60130-5  
CFA DIFCO 263810  
Pertussis Toxin Sigma P7208  
FcR blocking antibodies BD Biosciences 553142 Clone 2.4G2
Anti-CD11bPE mAb BD Biosciences 553311 Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs Biolegend 103116 Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%) EMS Inc 15710 Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel Life Technologies Inc. EC68855BOX  
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies Inc 4366596  
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies Inc 4304437  
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a Life Technologies Inc 4427975 ID 001182  
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 Life Technologies Inc 4427975 ID 001228  
Nuclease-free water Life Technologies Inc AM9937 Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate Life Technologies Inc. 4309849 Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml) Wheaton Science Products. 358044 Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer Falcon 352340  
Big centrifuge Sorval RT 6000B Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge Eppendorf 5415 R Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument Life Technologies Inc. AB 7900 HT Can be substituted with other instruments
Flow cytometer BD Biosciencess LSR II Can be substituted with other instruments
FACS BD Biosciences FACSAria Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000  

Referanslar

  1. Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
  2. Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
  3. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
  4. Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
  5. McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
  6. He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
  7. Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
  8. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
  9. Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
  10. Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  12. Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
  13. Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).

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Veremeyko, T., Starossom, S., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (65), e4097, doi:10.3791/4097 (2012).

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