Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.
Mikroglia sind Zellen der myeloischen Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) 1 befinden. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathologie vieler Krankheiten, die mit Neuroinflammation wie Multiple Sklerose (MS) 2 verbunden ist. Mikroglia bei einem normalen ZNS auszudrücken Makrophagen-CD11b und weisen eine Ruhestätte Phänotyp durch die Expression niedrigen Aktivierungsmarker wie CD45. Während pathologischen Prozessen im ZNS, werden Mikroglia aktiviert, bestimmt durch Hochregulation von CD45 und andere Marker 3. Die Faktoren, die Mikroglia-Phänotyp und Funktionen im ZNS betreffen sind nicht gut untersucht. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wachsende Familie von konservierten Molekülen (~ 22 Nukleotide lang), die in vielen normalen physiologischen Prozesse wie Zellwachstum und Differenzierung 4 und Krankheiten wie Entzündungen 5 beteiligt sind. MiRNAs herunterregulieren die Expression bestimmter Zielgenen durch Binden komplementärer Sequenzen derir mRNAs und spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des angeborenen Immunsystems Zellen, einschließlich Makrophagen 6 und Mikroglia 7. Um miRNA-vermittelten Pfade, die Mikroglia-Phänotyp, biologische Funktion zu definieren, und Mikroglia von anderen Arten von Makrophagen zu unterscheiden zu untersuchen, ist es wichtig, quantitative Erfassung der Expression bestimmter microRNAs in verschiedenen Teilmengen von CNS-ansässigen Mikroglia. Gängige Methoden zur Messung der Expression von miRNAs im ZNS gehören quantitative PCR aus ganzen neuronalen Gewebe und in situ Hybridisierung. Allerdings ist die quantitative PCR aus ganzen Gewebehomogenat nicht zulassen, die Bewertung der Expression von miRNA in Mikroglia, die nur 5-15% der Zellen des neuronalen Gewebes darstellen. In-situ-Hybridisierung erlaubt die Beurteilung der Expression von microRNA in spezifischen Zelltypen in den Gewebeschnitten, aber diese Methode ist nicht ganz quantitativ. In diesem Bericht beschreiben wir eine quantitative und Sensitive Methode zum Nachweis von miRNA durch real-time PCR in Mikroglia von normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für MS isoliert. Das beschriebene Verfahren wird nützlich sein, um die Höhe der Expression von microRNAs in Mikroglia im normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit verschiedenen Pathologien wie MS, Schlaganfall, traumatische Verletzungen, die Alzheimer-Krankheit und Hirntumoren zu messen.
Kürzlich wurde großes Interesse an Mikroglia und Beteiligung dieser Zellen bei vielen Erkrankungen, die mit Neuroinflammation und Neurodegeneration verbunden gegeben. Darüber hinaus wurde die Rolle von microRNAs bei der Differenzierung von Immun-und Krebszellen sich in den letzten Jahren gewachsen 5,10. Wir haben zuvor die Rolle der miR-124 in der Wartung von nicht-aktivierten oder ruhenden Phänotyp der Mikroglia im normalen ZNS-7 berichtet, aber die Rolle der anderen Arten von Mikro-RNAs in Mi…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde durch die NIH R01 NS071039-01A1 Forschungsstipendium unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
CFA | DIFCO | 263810 | |
Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |