בעבודה זו נסביר את ייצור ושימוש במיקסר microfluidic מסוגל ערבוב שני פתרונות ~~~HEAD=NNS 8 μs. כמו כן, אנו מדגימים את השימוש מערבלי אלה עם זיהוי ספקטרוסקופיות באמצעות הקרינה UV ותהודה הקרינה העברת אנרגיה (סריג).
תהליך שבו חלבון מתקפל לתוך קונפורמציה המקורית שלו רלוונטי במיוחד ביולוגיה בריאות האדם אך עדיין ממעטים להבין. אחת הסיבות לכך היא מתקפלת מתרחש על פני טווח רחב של לוחות הזמנים, החל ננו שניות עד שניות או יותר, תלוי חלבון 1. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי אפשרו מדידה של קינטיקה מתקפלים החל על 1 טרשת נפוצה. פיתחנו לאחרונה מערבל microfluidic כי מדלל denaturant ~ 100 של פי ~ 8 μs 2. שלא כמו מערבל הפסיקה זרימת, מערבל זה פועל משטר הזרימה למינרית שבו מערבולות אינה מתרחשת. העדר מערבולת מאפשר סימולציה נומרית מדויקת של כל תזרימי בתוך מיקסר עם הסכם מצוין להתנסות 3-4.
זרימה למינרית מושגת על מספרי ריינולדס מחדש ≤ 100. עבור תמיסות מימיות, זה דורש מידה הגיאומטריות מיקרון. אנו משתמשים מצע קשה, כמו סיליקון או sili התמזגוCA, כדי להפוך את ערוצי 5-10 מיקרומטר רחב ו 10 מיקרומטר עמוק (ראה תרשים 1). הממדים הקטנים ביותר, בכניסה לאזור ערבוב, הם בסדר גודל של 1 מיקרומטר בגודל. השבב הוא חתום עם זכוכית דקה או coverslip סיליקה מותכת עבור גישה אופטית. טיפוסי סך הכל תזרים ליניארי הם ~ 1 מ '/ ש, Re מניב ~ 10, אבל את צריכת החלבון הוא רק ~ 0.5 NL / s או 1.8 μL / שעה. ריכוז החלבון תלויה בשיטה זיהוי: עבור טריפטופן הקרינה ריכוז טיפוסי הוא 100 מיקרומטר (לחלבון 1 / TRP) ועל סריג ריכוז טיפוסי הוא ~ 100 ננומטר.
תהליך הקיפול הוא שיזם דילול מהיר של denaturant מ ז 6 ל hydrochloride 0.06 guanidine ז. חלבון denaturant גבוה זורם במורד הערוץ המרכזי מתקיים בכל צד על אזור חיץ על ידי ערבוב ללא denaturant נע ~~~HEAD=NNS 100 פעמים מהר יותר (ראה איור 2). גיאומטריה זו גורמת התכווצות מהירה של תזרים החלבון לתוך צרהמטוס ~~~HEAD=NNS 100 ננומטר רחב. דיפוזיה של מולקולות denaturant האור הוא מהיר מאוד, תוך דיפוזיה של מולקולות חלבון כבדות הרבה יותר לאט, מתפשטים והולכים פחות מ 1 מיקרומטר 1 טרשת נפוצה. ההבדל דיפוזיה מתמדת של denaturant והתוצאות חלבון בדילול מהיר של denaturant מהנחל חלבון, הקטנת ריכוז יעיל של denaturant סביב החלבון. מטוס חלבון זורם בקצב קבוע לאורך ערוץ התבוננות הקרינה של חלבון במהלך קיפול ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת 5.
ערבוב מהיר הייתה המטרה פיתוח בתחום קיפול חלבונים במשך שנים רבות משום שהיא מוכרת מזה זמן רב כי התהליכים המולקולריים של ביומולקולות להתרחש על סולמות זמן החל picoseconds כדי שניות. קונבנציונאלי עצר זרימה מערבלי יש פעמים המתים של 1-5 MS אשר מוגבלת בעיקר על ידי תסיסה. הסוערים מערבלי זרימה רציפה עם זמני ערבוב של 30-300 μs פותחו במהלך 15 השנים האחרונות על ידי מספר קטן של קבוצות, אך בדרך כלל דורשים ספיקות גבוהות כדי להשיג את הזמנים ערבוב ולכן משתמשים הרבה מדגם 6-8.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש של שבבי ערבוב microfluidic להשיג דילול מהיר של משטר זרימה למינרית. יש יתרונות רבים על עבודה במסגרת המשטר הזה, אבל העיקרית היא היכולת לדמות את תהליך ערבוב כל עם דיוק גבוהה, אשר מאפשר לשנות את התגובה ערבוב. T-מערבלי שפותחו על ידי קבוצות אחרות עם geom פשוטהetries הוכיחו פעמים ערבוב של 100-200 μs כי היו מוגבלים בעיקר על ידי גודל של 9-10 ערוצים. לפי קנה המידה את הגודל של הערוצים כדי נייט 10 מיקרומטר הפחית את הזמן כדי ערבוב ~ 10 μs 11. יאו ו Bakajin הראו כי שינויים קטנים בגיאומטריה יכול להוביל לשיפור משמעותי בזמן ערבוב 4. עם זאת, העבודה מראה כי האצת ערבוב יכול גם להוביל בשלבים איטיים יותר גם כן. העיצוב נעשה שימוש בעבודה זו 12-13 היא פשרה בין שני העיצובים הטובים ביותר התייחסות 4 כדי למזער את הדעיכה המעריכית איטי יותר בריכוז denaturant וגם להפוך תכונה לשחזור יותר תחריט DRIE.
יש כבר כמה מחלוקות בתחום ultrarapid ערבוב על ההגדרה של זמן ערבוב. חשוב להכיר את ההבדל בין "זמן ערבוב" ו – "זמן מת". זמן מת מוגדר במיקסר סוערת עם הזמן שבמהלכו מדידותלא לא יכול להיות ויכול למעשה להיות משמעותית יותר זמן ערבוב בפועל. זה נקבע בדרך כלל על ידי ביצוע מדידות שונות של תגובה פסאודו 1 כדי bimolecular (כגון מרווה של טריפטופן הקרינה על ידי N bromosuccinate) בריכוזים שונים. דועך מעריכית הנצפות מצוידים להתכנס לפי שווי אחת מניחה כי t = 0 s ואת הזמן בין נקודה לבין הנקודה נמדד הראשון הוא זמן מת. עבור מערבלי זרימה למינרית, מדידות יכול להתבצע בתהליך ערבוב אז אין זמן מת, רק זמן ערבוב. זמן ערבוב פשוט הזמן לשלב בין שני פתרונות עד אחידות מספיק הוא הגיע. הגדרנו קודם לכן את הזמן ערבוב להיות זמן 90/10, זמן הריכוז של denaturant להפחית בין 90% ל 10% משווי נפרדות. עם זאת, את הצורה של עקומת ערבוב אינו סימטרי לחלוטין עם זנב של ריקבון שיש מרכיב מעריכי קטן. יתר על כן, יש קיפול חלבוניםביותר שאינו ליניארי תלות ריכוז denaturant כך מתקפל שניתן לעיתים קרובות להתחיל גם אם denaturant מצטמצם רק פי 2. לכן הגדרנו ולאחרונה זמן ערבוב עם הזמן להפחית את ריכוז denaturant ב -80%. בהחלט הגדרות אחרות ניתן להשתמש בהתאם לדרישות של הניסוי.
שימוש במיקסר זה ללמוד קיפול חלבונים חשף באופן עקבי תוצאות מפתיעות. קיפול של ציטוכרום C ו apomyoglobin כבר מזמן למד להיות צעדים מתקפלים מספר רב של תוצאות מוקדמות עם מערבלי זרימה רציפה הראה קריסה להתרחש ב ~ 100 μs זמנים 10,14-15. המדידות שלנו עם מערבל זה הראה שיהיו לפחות 2 צעדים על לוח זמנים זה, מהר מאוד, סביר להניח שאינו ספציפי, קריסה (כפי שנמדד על ידי שינוי הקרינה trp רפאים) תוך פרק זמן של ערבוב במערבל ואחריו שלב איטי יותר (כמו נמדד על ידי מרווה מכלל פליטת TRP), כי סביר להניח First הקמת מבנה יליד 5. ראינו גם תהליך 50 μs בתחום B1 של L חלבון, הופכת את הפרשנות המקובלת כי חלבון זה הוא תיקיה 2 המדינות 13.
היתרון של מיקסר זה מהיר הוא שהוא יכול לחקור את קיפול של חלבונים מתקפלים המהיר ביותר אשר בדרך כלל היו רק measureable על ידי T-קפיצה מכשירים שבריר שנייה. T-קפיצה בדרך כלל דורש התבוננות קיפול / התגלגלות רגיעה ליד טמפרטורת ההתכה של חלבון ולכן לא עוקב המתקפל של האוכלוסייה. עם מערבל זו אנו בחנו מתקפל של γ-repressor (λ 6-86) עם פליטת הן בסך הכל TRP ו SHIFT רפאים מצאו עדויות כי חלבון אין מחסום קיפול בתנאים מתקפלים חזקים שלא היו נגישים T הקודמות הקפיצה מדידות 12. סוף סוף יש לנו למדוד את המתקפלים של כיסוי ראש villin HP-35, אחד לאהוא המהיר ביותר שנמדד תיקיות עדיין ומצא כי שיעור מתקפל נמדד לאחר ערבוב ~ 5 פעמים לאט יותר מאשר נמדד על ידי קפיצה-T באותם תנאים 16. הדבר מצביע על כך קינטיקה מתקפלים תלוי את תנאי הפתיחה, הופכת ההנחה העיקרית בתחום.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע FIBR (NSF EF-0623664) ו IDBR (NSF DBI-0754570). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון הקרן הלאומית למדע FIBR גרנט 0623664 מנוהל על ידי המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית PHY 0120999. מחקר של ליסה לפידוס, Ph.D. הוא נתמך בחלקו על ידי פרס קריירה ממשק מדעי מהקרן בורוז ברוך הבא.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | Ø: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
Microscope | Olympus | IX-51 | |
Microscope Objective | Thor Labs | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
Microscope Objective | Olympus | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
GaAsP Photon Counter | Hamamatsu | H7421-40 | |
Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
CCD camera | Andor Technology | iDus 420A-BU | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |