研究蛋白质折叠的微流体混合器

1。微流控混合芯片的制造 图3显示了基本的制作步骤。 4英寸（100毫米）的石英晶片清洁与新鲜Piranha溶液（3:1 H 2 SO 4：H 2 O 2的 ）：I）热硫酸130°C，然后倒在过氧化氢 ​​。请注意，表面粗糙度和石英晶片的平整度，发挥重要作用，最终粘接步骤。 ii）浸泡至少30分钟的晶圆。三）冲洗水和干燥5分钟。申请多晶硅（多晶硅）涂层，〜1微米厚的每人每旨在微通道的最后10微米的深度，利用低压化学气相沉积（LPCVD）炉。 清洁晶圆和掩膜步骤1.1食人鱼协议。清洁面膜以同样的方式，然后用清水冲洗，丙酮，甲醇和异丙醇，并立即吹干。脱水热板15晶圆0℃〜10分钟（使用铝箔帐篷，保持微粒），或在120°C的烤箱至少120分钟（最好隔夜）。要增加光阻附着力，立即暴露在温暖的晶圆HMDS的蒸汽5分钟。旋涂在晶圆与900毫微米AZ5214光阻软烤厚层在90°C直接上烤盘1分钟或30分钟（ 图3，步骤1）在110°C的烤箱。 对齐口罩和作出努力和真空接触。暴露在紫外线照射下，几秒钟（总能量：〜103兆焦耳/厘米2）（ 图3，第2步）。 AZ400K开发与DI水稀释4:1〜50秒，（光致抗蚀剂，直到被完全开发）的发展，同时轻轻搅拌。 2分钟后用清水冲洗。检查与显微镜的功能（ 图3，第3步）。如果功能不佳解决，去除光阻，并再次从1.2开始。硬烤115℃直接在烤盘2分钟。 灰粉或O 2等离子体descum晶圆在100 W的射频功率为2.5分钟。用深反应离子蚀刻（DRIE），蚀刻多晶硅层的方式，通过下面的石英。剩下的光阻去除与PRS2000抵抗在75°C，10分钟的脱衣舞。冲洗和干燥。测量蚀刻深度，以确保它是通过聚涂料（ 图3，第4步）。 使用ULVAC公司民盟-6000蚀刻，蚀刻石英每微米厚度的聚涂料（ 图3，第5步）〜10微米的深度，如氧化能力的DRIE。将穿在这聚涂层腐蚀掉，所以它可能需要在蚀刻过程中定期检查涂层的完整性。如果故意晶圆表面特征的地区已成为在蚀刻，剥离的裸聚的保护涂层，表面最有可能成为进站，将不再适合粘结在生产的最后步骤。在这种情况下，晶圆是最有可能不再可行。 4分钟，射频功率100瓦与矩阵舍清洁。剥去与XEF 2蚀刻（ 图3，第6步）的多晶硅。它可能需要重复步骤1.4这一步了几次，以消除所有的光致抗蚀剂和聚涂料。 旋转外套晶圆光阻一个新的〜1微米层保护的渠道，在后续处理。钻在每个芯片的入口和出口孔，采用计算机控制与喷砂（ 图3，第7步）钻石尖钻或手动。如果使用钻头，安装上牺牲的玻璃钢板，使用水族债券55晶片（功能朝下），注意保持焊机无气泡。冷却钻头与微观-90清洗液。这使小块玻璃，从坚持的渠道，然后堵塞在使用过程中的芯片。 直接用注射器注入瓦特水冲洗晶圆亚特到每个孔。在肥皂水里浸泡一小时。删除与减贫战略2000光刻胶和水族债券几个小时，直到表面是干净的，在60°C。 DI水和温暖的肥皂水冲洗晶圆。再次冲洗每孔用注射器，避免蚀刻的功能。与氮，在真空烘箱干燥晶圆设置为120°C。检查孔，以确保它们的砂砾和重复清洗的必要步骤。衡量一个光学或机械表面轮廓（ 图3，第8步）渠道的深度。 清洁晶圆和同等数量为170微米厚的石英盖玻片1）Piranha溶液（1-2小时，按1.1的程序），2）RCA（5时01分01秒的DI：盐酸H 2 0 2的RCA 1解决方案（5时01分01秒的DI：22分钟，在75C H 2 O 2））：NH 4 OH）溶液在75℃10分钟，3）。 DI水冲洗5分钟，每个解决方案之间。 顶部朝上放置一个晶片功能一摞3-4洁净室抹布放在平坦的表面硬上，如一个小窗格玻璃，。晶圆至少5分钟，用氮气彻底干燥。重复与玻璃盖。边拿起玻璃盖，倒置等打磨方朝下举行了晶圆对准平面边缘。仔细拖放到晶圆的玻璃盖，并允许它来解决。只有微调横向调整对齐。向下推，用一个手指晶圆中心。每个人都应该看到粘接前开始向外辐射。如果有必要，申请额外的压力，晶圆周围的其他职位，以推进粘接前（ 图3，第9步）。 设置坡道从室温到800℃超过3小时的高温烤箱放置在密封的晶圆，然后从800 – 1100℃以上，另1.2小时。保持在1100℃2小时，然后急剧下降，超过1.5小时，室温。 到我看到了一个晶圆切割的骰子ndividual芯片（ 图3，第10步）。 协议描述制造相当不寻常的石英衬底紫外​​检测是必要的渠道。但是，这个协议也可以适用于硅衬底，这就要求只有一个蚀刻步骤2。可以结合使用阳极键合晶圆玻璃（但不熔融石英）玻璃盖。 2。安装和载入芯片多方面的持有混合芯片和解决方案，可制成塑料的Lexan或有机玻璃，或温度控制的铝（ 见图4），如。如果使用铝，解决水库应涂以聚对二甲苯，在水库的盐溶液，以防止铝解散。热电装置安装两侧和电子控制器，可以控制整个多方面的，解决方案和芯片的温度。 该芯片是交配的玛尼小O形圈和一个挡圈，允许一个清晰的光学芯片中心在地方举行倍。 O型环槽较浅的芯片没有施加太大压力，以确保良好的交配应该是比标准，即1 002 O形圈应该是深0.025“，一旦芯片的安装，添加解决方案中心和侧面水库，照顾释放被困在井底部有气泡。 因为在此混频器所使用的量是如此之小，可以控制流量，与上面的解决方案，井应用于空气压力。 图4显示芯片多方面的顶部由O形圈的压力多方面的交配。压力歧管连接到计算机控制的压力传感器可以保持〜2-80 PSI的压力。该芯片已经设计等平等中心和侧通道的压力产生了〜100倍，比线性流速。在20 PSI的，在退出渠道的线性流速约1米/秒。 放置在一个倒置显微镜多方面的，检查混合目镜或摄像机输出的地区。多方面的顶部放置一个白炽灯手电筒将提供足够的光线。在中心通道使用染料或高指数的折射解决方案（即6个M盐酸胍）查看射流。 在平等中心和侧通道的压力，喷射将难以看到眼睛，所以开始在0 PSI侧通道的压力，慢慢增加至等于压力。如果一方的通道被堵塞，飞机将被推迟对出口通道的墙壁之一。如果出现一个可见的堵塞，它可能会脱落，通过施加压力或真空用注射器的出口通道。 如果蛋白质或其他有机物质堵塞的芯片，它可以清洁浸泡过夜Pirhana解决方案，。 3。数据采集 图5显示了基本的光学仪器布局。把使用显微镜外分色镜内或只是显微镜研究级的准直激光束。对齐，使激光焦点在目镜或混合区域附近有些相机可以看到。 从搅拌机中蛋白质的荧光收集的目标和发送通过分色镜，由一个针孔镜头聚焦成像对光子计数器。芯片使用在x和y的压电扫描器扫描图像的混合地区（典型的步长是2微米）。选择一个位置上的喷气机和X和Z扫描，发现在垂直通道的中心焦点。在显微镜领域的深度远远超过航道水深和流速是在通道除了在1微米的墙壁统一。因此，确定的时空分辨率的观测荧光主要的聚焦点的大小。 水平扫描范围内的出口通道（典型步骤sIZE是在整个喷射0.2微米，2微米100微米增量观察，沿射流〜1毫秒每个位置）沿射流（ 见图6）。沿着喷气显微镜阶段捕捉稍后的时间由80-90微米。 另外，光可检测由光谱仪和CCD用镜头聚焦到狭缝后的分色镜。由于数据收集是比光子计数器，每个位置（1秒）慢，通常喷射第一次成像与光子计数器，然后沿射流光谱仪测量点（ 见图7）。 从光子计数器的数据进行分析总结3-5像素周围喷射，在每个位置创建一个强度与距离的阴谋。时间的计算是从使用距离计算速度的基础上所施加的压力（ 见图8）。 从光谱仪的数据进行分析的几种方法。 FRET，channe指定为“捐助”和“受体”的LS可以概括和接近率 E = /（我的D + 的 I D）计算（ 见图9）。另外，单值分解，可以执行独立的频谱分量与时间，如色氨酸的发射光谱作为一种蛋白质折叠的转变，来看看。 退出通道的距离内，可以转换时间取决于所施加的压力侧通道使用恒定的流量。出口通道内的第2微米〜100倍的蛋白质射流的流速加快，并在该地区的时间必须与有限元分析计算的简化（生产时间在绘制图8）。这个加速度产生的偏移〜1-2微秒后的速度成为常数，通常可以忽略在测量动力学比混合慢得多。 4。代表结果 图6显示了一个由光子计数器测量的混合区强度的等高线图。在射流外的退出渠道的背景应该是接近探测器的本底噪声，通常是不减去。较高的背景可能显示不协调或蛋白质坚持通道的墙壁。看起来扭曲或弯曲，特别是附近的混合区，喷气式飞机，表明穷人的喷嘴蚀刻。 图7显示了蛋白质的酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）与488网站和Alexa 647标记的时间分辨光谱。这个数据已经背景减去删除黑暗的充电和激光信号。中心通道设置为0 PSI压力的背景信号。 搅拌时间可以测量通过测量的快速反应速度远远比混合，如色氨酸荧光猝灭bŸ碘化钾或崩溃的单链DNA标记与FRET的染料，加入NaCl。由于飞机是小于光学显微镜的分辨率，有喷气形式的混合区，在大强度下降。控制无解条件的变化。 图8显示的比例混合（碘化钾400毫米）和N-乙酰色氨酸酰胺荧光非混合实验测量，该仪器的响应可以被删除。该行显示从COMSOL模拟预测浓度的KI。搅拌时间，只要浓度减少80％的时间来衡量，是8微秒。 由于数据是在100微米增量沿500微米长的退出渠道收集，数据必须粘贴在一起，从多个视图。有这些意见，可能是由于在重点的小芯片是由移动显微镜阶段的变化之间的偶尔小信号偏移。由移动的舞台，80或90按次微米，这些偏移可以消除通过检查重叠的数据。通常情况下，数据收集至少有两个流速和数据相结合，以确认任何信号的变化是由于真正的光谱变化中的蛋白质，而不是光或流动的影响， 图9显示的共振稀释后的蛋白ACBP变化变性从6米至0.06研究这个数据不需要对照实验中，自共振已经是一个比和仪器的响应已被删除。 T = 0的附近迅速蹿代表在共振信号混合的时间内迅速变化。 图1。电子显微镜测量混合区的布局。 图2。水力混合研究蛋白质折叠的示意图。蛋白质，开展高变性溶解，流下来，对混合区的中心通道，满足缓冲流动快〜100倍。层流强制蛋白质从变性的分子能迅速扩散成一个窄窄的喷射流。由于喷气流下来的退出渠道，可以观察到蛋白质与高空间和时间的使用共聚焦显微镜的分辨率。 图3。熔融石英制造。 1）过程开始于一个高度抛光的500微米厚的石英衬底的多晶硅层的顶部和底部表面上沉积（聚）（一），（b）和旋涂一层光阻（三）。 2）光罩（五）被带来的诠释 o与晶圆和光致抗蚀剂的硬接触，暴露在紫外光（D）。 3）晶圆被放置在一个开发浴和模式显示，在光致抗蚀剂。 4）晶圆被放置在一个的DRIE蚀刻进入前聚涂层的功能。光致抗蚀剂，然后删除。 5）聚然后充当面膜当晶圆被放置在氧化物蚀刻和功能蚀刻10 – 40微米的石英衬底。 6）聚涂层，然后在XEF 2蚀刻去除。 7）晶圆保税牺牲玻璃板与热活化胶（G），功能的一面朝下，并从背面的通孔的金刚石钻头（F）abrasively演习。 8）表面轮廓（H），然后直接测量蚀刻的功能深度。 9）170微米厚的熔融石英盖玻片晶圆对晶圆的顶部表面直接结合。 10）晶圆被切割成个别的微流控芯片。 3976/3976fig4.jpg“/> 图4。混频器多方面的。微流体芯片的安全解决方案与加工铝面板和四个O形圈〜200μL，水库下多方面的。通过一个大洞，加工中心，直接在上面贴的微芯片的混合地区多方面的，使过量的紫外线光散射，抑制任何从多方面本身的自动荧光逃脱，不用允许用肉眼直接照明芯片或相机对准。空气歧管密封各水库等，在每一个空气压力可以通过外部的压力控制箱控制。 图5。光学共聚焦显微镜的原理图。 图6。轮廓色氨酸的阴谋荧光微搅拌机。混合区位于y轴〜90微米。 图7。时间依赖性荧光光谱收集的搅拌机内。红色和绿色的矩形显示指定为供体和受体通道的波长，分别。 图8。测定色氨酸的荧光猝灭碘化钾（点和右轴）和有限元分析（线和左轴）计算的混合时间。 图9。FRET技术在折叠的蛋白质ACBP测量的变化。 T = 0附近的迅速崛起，代表了一阵搅拌的时间内和较慢的上升阶段代表一个渐进的累加TION作为蛋白质折叠结构。数据采取了两种不同的流速和覆盖，从而导致在不同的时间不同密度的测量。