Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

1. Fabrication de Chips de mélange microfluidique La figure 3 montre les étapes de fabrication de base. Nettoyez 4 pouces (100 mm) des plaquettes de silice fondue avec une solution Piranha frais (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) la chaleur de l'acide sulfurique à 130 ° C, puis versez dans le peroxyde. Notez que la rugosité de surface et la planéité des plaquettes de silice fondue utilisé jouent un rôle important pour l'étape de collage final. ii) immerger les plaquettes pendant au moins 30 minutes. iii) Rincer pendant 5 minutes avec de l'eau et à sec. Appliquer une polysilicium (poly) revêtement, ~ 1 um d'épaisseur par tous les profondeur de 10 um destiné des canaux microfluidiques, finales en utilisant un produit chimique à basse pression dépôt en phase vapeur (LPCVD) du four. Nettoyer les plaquettes et le masque en utilisant le protocole Piranha à l'étape 1.1. Nettoyez le masque de la même manière, puis rincer avec de l'acétone, le méthanol et l'isopropanol et sécher immédiatement. Déshydrater les plaquettes sur une plaque chauffante à 150 ° C pendant environ 10 minutes (utilisez une feuille d'aluminium tente de garder les particules loin) ou dans un four à 120 ° C pendant au moins 120 minutes (une nuit de préférence). Pour augmenter l'adhérence de résine photosensible, immédiatement exposer les plaquettes chaudes à la vapeur d'HMDS pendant 5 minutes. Spin manteaux des plaquettes avec une couche ~ nm d'épaisseur de 900 AZ5214 résine photosensible et cuire au four doux à 90 ° C directement sur ​​une plaque de cuisson pendant 1 minute ou dans un four à 110 ° C pendant 30 min (Figure 3, étape 1). Aligner le masque et de faire un contact dur et vide. Exposer à la lumière UV pendant quelques secondes (l'énergie totale: ~ 103 mJ / cm 2) (figure 3, étape 2). Développer avec AZ400K développeur, dilué 4:1 avec de l'eau DI pour ~ 50 secondes (jusqu'à résine photosensible est entièrement développé), tandis que en agitant doucement. Rincer à l'eau pendant 2 minutes. Inspectez caractéristiques avec microscope (Figure 3, étape 3). Si les fonctions sont mal résolus, dépouiller la résine photosensible et recommencez à partir de 1.2. Dur cuire à 115 ° C directement sur une plaque chauffante pour 2minutes. Plaquettes Descum avec Asher ou plasma O 2 pendant 2,5 minutes à 100 W de puissance RF. L'utilisation d'un profond ionique réactive graveur (MEIR), gravure de la couche de silicium polycristallin tout au long de la silice fondue ci-dessous. Bande le photorésist restant avec PRS2000 résister décapant à 75 ° C pendant 10 minutes. Rincez et séchez. Mesurer la profondeur de gravure afin de s'assurer qu'elle est tout le chemin à travers le revêtement de poly (Figure 3, étape 4). Utilisation d'un oxyde de MEIR apte tel qu'un ULVAC LND-6000 graveur, gravure de la silice fondue jusqu'à une profondeur de ~ 10 um par micron d'épaisseur du revêtement de poly (figure 3, étape 5). Ce revêtement poly sera porté loin lors de la gravure, de sorte qu'il peut être nécessaire pour vérifier l'intégrité du revêtement périodiquement pendant le processus de gravure. Si les régions sans traits intentionnellement de la surface de la plaquette sont devenus à nu de la couche protectrice de poly lors de la gravure, la surface a très probablement devenir dénoyautées et ne sera plus adaptée pour le collagedans les étapes finales de la production. Dans ce cas, la plaquette est plus probable n'est plus viable. Nettoyez-le avec l'Aser matrice pendant 4 minutes, 100 W de puissance RF. Dénuder le polysilicium avec un graveur XeF 2 (Figure 3, étape 6). Il peut être nécessaire de répéter l'étape 1.4 et cette étape plusieurs fois pour enlever tous les revêtements de résine photosensible et poly. Spin plaquettes manteau avec une nouvelle couche de ~ 1 um de résine photosensible pour protéger les voies lors des manipulations ultérieures. Percez des trous d'entrée et de sortie dans chaque puce en utilisant un ordinateur contrôlé foret diamanté ou manuellement avec une sableuse (Figure 3, étape 7). Si vous utilisez une perceuse, monter la plaquette (fonction vers le bas) sur une plaque de verre en utilisant Aqua sacrificielle Bond 55, en prenant soin de garder la colle exempte de bulles. Refroidir le foret avec une solution de nettoyage micro-90. Cela permet de maintenir de petits morceaux de verre de coller à des canaux qui a ensuite obstruer la puce lors de l'utilisation. Rincer la plaquette avec de l'eau DI à l'aide d'une seringue pour injecter water dans chaque trou. Faire tremper dans de l'eau savonneuse pendant une heure. Retirer de résine photosensible et Bond Aqua avec PRS 2000 à 60 ° C pendant plusieurs heures jusqu'à ce que la surface est propre. Rincer avec de l'eau DI plaquette et de l'eau chaude savonneuse. Rincer à nouveau chaque trou avec une seringue, en évitant les caractéristiques gravées. Plaquette à sec avec de l'azote et dans une étuve à vide réglé à 120 ° C. Inspectez les trous afin de s'assurer qu'ils sont exempts de grain et répéter les étapes de nettoyage si nécessaire. Mesurer la profondeur des canaux avec soit une profileur surface optique ou mécanique (figure 3, étape 8). Plaquettes propres et un nombre équivalent de 170 um d'épaisseur soudés verres de couverture de silice avec 1) une solution Piranha (1-2 heures selon la procédure au point 1.1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) solution pendant 10 minutes à 75 ° C, 3) RCA solution à 1 (5:01:01 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) pendant 22 minutes à 75C). Rincer à l'eau DI pendant 5 minutes entre chaque solution. Placer les tranches caractéristiques d'un côté sur le dessus deune pile de lingettes pour salles blanches 3-4 placés sur le dessus d'une surface plane et dure, comme un volet petite plaque de verre. Sécher soigneusement avec la plaquette de l'azote gazeux pendant au moins 5 minutes. Répéter l'opération avec couvercle en verre. Pick up couvercle en verre par le bord et inverser de telle sorte que le côté poli est face vers le bas a tenu sur la plaquette et d'aligner les bords plats. Soigneusement tomber le couvercle en verre sur la tranche et lui permettre de décanter. Déplacer horizontalement uniquement pour régler l'alignement. Poussez vers le bas avec un doigt sur le centre de la plaquette. Il faut voir un front de liaison commencent à rayonner vers l'extérieur. Si nécessaire, appliquer une pression supplémentaire à d'autres postes autour de la tranche pour faire avancer le front de liaison (Figure 3, étape 9). Placez les tranches de scellés dans un four à haute température réglée sur la rampe de température de la pièce à 800 ° C pendant 3 heures, puis de 800 à 1100 ° C au-dessus encore 1,2 heures. Tenez à 1100 ° C pendant 2 heures, puis descente de la rampe à température ambiante pendant 1,5 heure. Dice avec un découpage en tranche vu iertaines puces (Figure 3, étape 10). Le protocole décrit la fabrication de chaînes dans le substrat de silice fondue assez inhabituel qui est nécessaire pour la détection UV. Mais ce protocole peut également être adapté pour un substrat de silicium qui ne nécessite qu'une seule étape de gravure 2. Un verre (mais pas de la silice fondue) en verre de couverture peut être lié à la plaquette en utilisant une liaison anodique. 2. Le montage et le chargement Chips Le collecteur de tenir la puce de mélange et des solutions peuvent être en plastique, tels que Lexan ou en plexiglas ou en aluminium pour le contrôle de la température (voir figure 4). Si utilisant de l'aluminium, les réservoirs de solution doit être revêtue d'parylène pour empêcher la dissolution de l'aluminium par les solutions de sels dans les réservoirs. La température du collecteur d'ensemble, et des solutions à puce peut être commandé avec des dispositifs thermoélectriques monté sur les côtés et un contrôleur électronique. La puce est associé à la manipli par petite joints toriques et une tenue en place par une bague de retenue qui permet une vue dégagée optique du centre de la puce. Les rainures toriques devrait être moins profonde que la norme pour assurer l'accouplement bonne sans appliquer trop de pression à la puce, c'est à dire, un 002 o-ring doit être de 0,025 "de profondeur. Une fois la puce est montée, ajouter des solutions dans les réservoirs du centre et du côté , en prenant soin pour libérer les bulles piégées au fond des puits. Parce que les quantités utilisées dans ce mélangeur sont si petites, le débit peut être contrôlée par la pression d'air appliquée au-dessus des puits de solution. Figure 4 représente le collecteur de pression accouplée à la partie supérieure du collecteur puce par les joints toriques. La pression du collecteur est relié à des capteurs de pression contrôlés par l'ordinateur qui peuvent maintenir les pressions de ~ 2-80 PSI. La puce a été conçue de telle sorte que des pressions égales sur les canaux du centre et produire un côté ~ 100 fois rapport des débits linéaires. À 20 PSI, le débit linéaire dans le canal de sortie est d'environ 1 m/ S. Placez le distributeur sur un microscope inversé et d'examiner le mélange région avec l'oculaire ou sortie de la caméra. Une lampe de poche à incandescence placée au-dessus du collecteur se fournir suffisamment de lumière. Utilisation d'un indice élevé de colorant ou une solution de réfraction (c.-à-6 M de chlorhydrate de guanidine) dans le canal central pour afficher du jet. A une pression égale sur les canaux du centre et de côté, le jet sera difficile de voir à l'oeil afin de commencer avec la pression à canal latéral à 0 PSI et augmenter lentement à une pression égale. Si un canal latéral est obstrué, le jet est poussé contre une des parois du canal de sortie. Si un sabot visible apparaît, il peut être délogé par une pression ou un aspirateur pour le canal de sortie avec une seringue. Si la protéine ou d'un autre matériau organique obstrue la puce, il peut être nettoyé par immersion dans une solution Pirhana nuit. 3. Collecte des données La figure 5 montre la disposition instrument optique de base. Amener un faisceau laser collimaté dans un microscope de recherche de qualité en utilisant un miroir dichroïque à l'intérieur ou juste à l'extérieur du microscope. Aligner le laser de sorte que la mise au point peut être vu dans l'oculaire ou une caméra un peu près de la zone de mélange. La fluorescence de la protéine dans le mélangeur est recueilli par l'objectif et envoyé à travers le miroir dichroïque, focalisé par une lentille à sténopé et une imagé sur un compteur de photons. Numériser la puce en utilisant un scanner piézoélectrique en x et y de l'image de la région de mélange (étape taille typique est de 2 um). Choisir une position sur le jet et de balayage en x et z pour trouver le point au centre du canal vertical. La profondeur de champ du microscope est très inférieure à la profondeur du canal et le débit est uniforme dans le canal sauf dans 1 um des parois. Par conséquent, la résolution temporelle de la fluorescence observée est principalement déterminée par la taille de la tache confocale. Numérisation horizontalement dans le canal de sortie (typique étape size est de 0,2 um à travers le jet, 2 pm le long du jet) en incréments de 100 um le long du jet, d'observation du ~ 1 ms par position (voir figure 6). Déplacer la platine du microscope par 80-90 um le long du jet d'immortaliser un moment plus tard. En variante, la lumière peut être détectée par un spectrographe et CCD après le miroir dichroïque utilisant une lentille pour focaliser la lumière sur la fente d'entrée. Depuis la collecte des données est plus lente que pour le compteur de photons (1 seconde par poste), généralement le jet est imagée d'abord avec le compteur de photons, puis des points le long du jet sont mesurées avec le spectrographe (voir Figure 7). Les données du compteur de photons est analysé en additionnant 3-5 pixels autour du jet à chaque position pour créer une parcelle de l'intensité par rapport à la distance. Le temps est calculé à partir de la distance en utilisant une vitesse calculée en fonction des pressions appliquées (voir figure 8). Les données provenant du spectrographe peut être analysée de deux façons. Pour le FRET, channels désignés comme «donneur» et «accepteur» peuvent être additionnés et le rapport de proximité E = I A / (I + D I D) calculée (voir la figure 9). Alternativement, la décomposition seule valeur peut être effectuée à regarder indépendants composantes spectrales en fonction du temps, tels que le changement dans le spectre d'émission du tryptophane en tant que protéine se replie. La distance dans le canal de sortie peut être converti à l'heure en utilisant le débit constant déterminé à partir de la pression appliquée aux canaux secondaires. Dans les 2 premiers um de la voie de sortie, le débit du jet protéine accélère ~ 100x et les temps de cette région doit être calculé avec analyse par éléments finis des lignes de courant (produire des moments représentés à la figure 8). Cette accélération produit un décalage de ~ 1-2 ms après la vitesse devient constante et peut habituellement être ignorée dans la mesure cinétique beaucoup plus lente que le mélange. 4. Les résultats représentatifs La figure 6 montre un tracé de contours de l'intensité dans la région de mélange mesurée par le compteur de photons. L'arrière-plan dans le canal de sortie en dehors du jet doit être proche du niveau de bruit du détecteur et n'est généralement pas soustrait. Un fond plus élevé peut indiquer un mauvais alignement ou que la protéine est collé aux parois du canal. Un jet qui ressemble plié ou tordu, surtout près de la zone de mélange, indique une gravure médiocre des buses. La figure 7 montre la résolution dans le temps des spectres de la protéine acyl-coenzyme A-binding protein (ACBP) marqué avec l'Alexa 488 et Alexa 647. Ces données ont été soustraites de fond pour enlever la charge sombre et signal laser. Le signal de fond a été prise avec la pression du canal central fixé à 0 PSI. Le temps de mélange peut être mesurée par la mesure d'une réaction rapide qui est beaucoup plus rapide que de mélanger comme Trp extinction de la fluorescence by KI ou l'effondrement de l'ADN simple brin, marqué avec FRET colorants, par l'addition de NaCl. Parce que le jet est plus petite que la résolution optique du microscope, il ya une chute d'intensité grande dans la région de mélange des formes à jet. Cette réponse de l'instrument peut être retiré par une mesure de contrôle dans lequel aucun changement solution conditions. La figure 8 montre le rapport de mélange (en 400 mM KI) et non-mélange des expériences de la N-acétyl fluorescence amide tryptophane. La ligne indique la concentration prévue de KI à partir de simulations COMSOL. Le temps de mélange, comme mesuré comme le temps de la concentration de diminuer 80%, est de 8 ms. Comme les données sont collectées par incréments de 100 um le long du canal de sortie 500 um de long, les données doivent être collées ensemble à partir de plusieurs vues. Il ya des décalages de temps en temps des petits dans le signal entre ces points de vue, probablement à cause de petits changements dans la mise au point que la puce est proposé par la platine du microscope. En déplaçant la scène 80 ou 90um par vue, ces décalages peuvent être éliminés en examinant les données qui se chevauchent. Généralement les données sont recueillies avec au moins deux débits et les données sont combinées pour confirmer les modifications de signal sont dues à de véritables changements spectroscopiques de la protéine, plutôt que des effets optiques ou de débit. La figure 9 montre le FRET changements dans la protéine de ACBP après dilution de dénaturant de 6 M à 0,06 M. Ces données ne nécessite pas une expérience de contrôle depuis le FRET est déjà un rapport et la réponse de l'instrument est déjà supprimé. Le saut rapide à proximité de T = 0 correspond à une variation rapide de FRET de signal dans le temps de mélange. Figure 1. Disposition de région de mélange mesurée par microscopie électronique. Figure 2. Schéma de mélanger hydrodynamique pour étudier le repliement des protéines. La protéine,dissous dans dénaturant haute pour la déplier, coule le canal du centre vers la zone de mélange où il rencontre un tampon qui coule ~ 100 fois plus rapide. À flux laminaire le flux de force protéine dans un jet étroit à partir de laquelle les molécules dénaturant peut diffuser rapidement. Comme le jet coule dans le canal de sortie, la protéine peut être observée avec une résolution spatiale et temporelle élevée en utilisant un microscope confocal. Figure 3. De fabrication en silice fondue. 1) Procédé commence par une très polie 500 um de silice fondue substrat épais (a) avec une couche de polysilicium (poly) déposée sur les surfaces supérieure et inférieure (b) et de spin-revêtue d'une couche de photorésist (c). 2) un photomasque (e) est amené int o contact dure avec la tranche et le photorésist est exposé à une lumière UV (d). 3) Le plaquette est placé dans un bain révélateur et le motif est révélé dans la résine photosensible. 4) la plaquette est placé dans une MEIR et les caractéristiques sont gravés dans le revêtement supérieur poly. Le photorésist est ensuite retiré. 5) le poly agit alors en tant que masque lorsque la tranche est placée dans un graveur oxyde et les caractéristiques sont gravées de 10 à 40 um dans le substrat en silice fondue. 6) Le revêtement poly est ensuite retiré dans un XeF 2 graveur. 7) La plaquette est lié à une plaque de verre sacrificiel avec un matériau d'étanchéité activé par la chaleur (g), côté caractéristiques vers le bas, et un trépan de forage de diamant (f) par abrasion forets trous traversants de la face arrière. 8) Un profileur de surface (h), puis de mesurer directement les profondeurs métrages gravées. 9) A 170 um plaquette condensé lamelle de silice est directement collé sur la surface supérieure de la plaquette. 10) La plaquette est découpée en différentes puces microfluidiques. 3976/3976fig4.jpg "/> Figure 4. Le collecteur mélangeur. Le microfluidique-puce est fixée à la tubulure solution avec une plaque frontale d'aluminium usiné et quatre joints toriques dans les réservoirs de ~ 200 pL. Un grand trou est usinée par le centre de la tubulure directement au-dessus de la région de mélange de l'apposé microfluidique-puce, permettant à la lumière UV en excès de s'échapper sans rétrodiffusion, inhiber toute autofluorescence du collecteur d'elle-même et permettant un éclairage direct de la puce par l'oeil ou un appareil photo pour l'alignement. Les joints de collecteur d'air chacun des réservoirs de telle sorte que la pression d'air dans chaque peuvent être commandés par l'intermédiaire d'une boîte de commande de pression externe. Figure 5. Schéma d'un microscope optique confocal. Figure 6. Tracé de contours de tryptophanela fluorescence dans le mélangeur microfluidique. La région de mélange est situé à ~ 90 um sur l'axe des y. Figure 7. Temps spectres dépend fluorescente recueillies dans le mélangeur. Les rectangles verts et rouges indiquent les longueurs d'onde désignés comme canaux donneur et accepteur, respectivement. Figure 8. Le temps de mélange mesurée par extinction de la fluorescence du tryptophane par l'iodure de potassium (points et axe de droite) et calculé par analyse par éléments finis (en ligne et axe de gauche). Figure 9. FRET changements mesurés pendant le pliage de la protéine ACBP. L'augmentation rapide de près de t = 0 représente une phase d'éclatement dans le délai de mélange et le ralentissement de la hausse représente une accumulation progressivetion de structure telle que les plis de protéines. Les données ont été prises à deux débits différents et l'on couvrit, conduisant à des densités différentes de mesures à différents moments.