Nós desenvolvemos um citômetro de fluxo, utilizando ultra-som para detectar a laser induzida circulando células de melanoma como um indicador precoce de doença metastática.
Células tumorais circulantes (CTCs) são as células que se separaram de um tumor macroscópico e difundir através dos sistemas de sangue e da linfa aos tumores secundários de sementes 1,2,3. CTCs são indicadores de doença metastática e sua detecção em amostras de sangue podem ser usados para diagnosticar o câncer e monitorar a resposta do paciente à terapia. Desde CTCs são raros, compreendendo cerca de uma célula tumoral entre bilhões de células sanguíneas normais em pacientes com câncer avançado, a sua detecção e enumeração é uma tarefa difícil. Nós explorar a presença de pigmento na maioria das células do melanoma para gerar fotoacústica, ou laser induzida ondas ultra-sônicas em um citômetro de fluxo personalizado para a detecção de células de melanoma circulantes (CMCs) 4,5. Este processo implica separar uma amostra de sangue total usando centrifugação e obter a camada de células brancas do sangue. Se presente no sangue total, CMCs vai separar com as células brancas do sangue, devido à densidade semelhante. Estas células são ressuspendidas emtampão fosfato (PBS) e introduzido o medidor de vazão. Ao invés de um fluxo contínuo de suspensão de células do sangue, que induziu duas fluxo da fase a fim de capturar essas células para posterior estudo. Em dois fluxo de fase, dois líquidos imiscíveis em um sistema microfluídicos se encontram em uma junção e forma alternada slugs de 6,7 líquidos. PBS suspensão glóbulos brancos e lesmas ar microlitro forma que são seqüencialmente irradiado com luz laser. A adição de um surfactante para a fase líquida permite a formação slug uniforme e que o usuário pode criar diferentes lesmas porte, alterando as taxas de fluxo de duas fases. Lesmas do ar e lesmas de PBS com células brancas do sangue não contém absorvedores de luz e, portanto, não produzem ondas fotoacústica. No entanto, lesmas de células brancas do sangue que contêm mesmo CMCs única absorvem a luz laser e produzir ondas acústicas de alta freqüência. Essas lesmas que geram ondas fotoacústica são seqüestrados e recolhidos para a coloração citoquímica para verificção de CMCs.
Detecção de CTCs ainda é um campo de pesquisa intensiva com muito poucas aplicações clínicas devido ao problema difícil de isolar as células do tumor raro. Muitas outras técnicas estão sendo avaliadas para CTC detecção, incluindo RT-PCR, captura célula microfluídica, captura imunomagnética, e outros métodos 8-12. No entanto, a detecção fotoacústica da mostra CMCs promessa como é rótulo livre e fornece um meio rápido e preciso para capturar pequenas partículas de luz absorvente.
O protocolo descrito para isolar as células brancas do sangue é altamente eficiente, mas um baixo número de glóbulos vermelhos existem na amostra. Estas células rouge contaminando também absorvem a luz laser, mas a um nível bastante reduzido. Para garantir os glóbulos vermelhos não interferem com o nosso sistema de detecção de melanoma, cinco amostras de pacientes saudáveis foram introduzidas através do sistema e não deu um sinal, indicando que as células vermelhas do sangue estão presentes em baixas concentrações o suficiente paraser desconsiderada.
Uma série de estudos de concentração foram realizados com células de melanoma cultivadas eo sistema de fluxo fotoacústica mostrou sensível até 1 célula / mL (dados não publicados). Estes estudos estão em curso e em breve incluirá ensaios utilizando amostras de doentes de câncer.
Esta técnica fotoacústica também está sendo avaliado para uso em não-pigmentadas CTCs, como de mama e câncer de próstata, anexando cromóforos exógenos. Temos realizado um trabalho preliminar usando nanopartículas de ouro sobre o câncer cells13. Estes testes mostraram que as nanopartículas podem proporcionar a absorção óptica necessária para gerar ondas fotoacústica. O desafio técnico é demais para anexar tais partículas de células de câncer seletivamente.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos o apoio do Departamento de Engenharia Biológica e Christopher S. Life Bond Centro de Ciências da Universidade de Missouri. Reconhecemos apoio financeiro da Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 e NIH R21CA139186-0. Também agradecemos ao Programa Life Sciences Research Opportunity Graduação da Universidade de Missouri, a Universidade de Missouri Núcleo Citologia Molecular e da Universidade de Missouri Faculdade de Engenharia de apoio financeiro.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |