단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.
수많은 연구 심장 조직의 homogenates에서 유전자 발현 변화를 조사하고 있지만, 이것은 조직 내의 세포 사이의 고유의 확률적 변화를 공부하고 방지할 수 있습니다. 마우스 마음 collagenase 재관류를 통해 순수한 cardiomyocyte 인구의 격리는 전체 transcriptome 유전자 발현에 대한 단세포 microarrays의 생성, 또는 nanofluidic 배열을 사용하여 특정 대상의 qPCR을 용이하게합니다. 우리는 여기서 마음에서 격리 cardiomyocytes의 단일 세포 유전자 발현 프로파일을 조사하는 절차를 설명합니다. 이 패러다임은 유전자 발현의 평가 (그림 1) 종래의 전체 조직 워크플로를 사용 가능한 경우는 아니지만 (조직 내의 세포 사이의 예제 분산을위한) 의미에 의존하지 않습니다 흥미 통계 평가 수 있습니다. 우리는 전에 microarrays의 사용을 용이하게 이중 좌초 cDNA의 단일 세포 transcriptome 항복 마이크로 그램의 강력한 증폭을 달성ndividual 세포. 절차에서는 사용하고 자신의 디자인을 사용자 정의할 수있는 기능들의 편리를 위해 선택되었다 NimbleGen 배열의 사용을 설명합니다. 또는 반대 transcriptase – 구체적인 목표 증폭 (RT – STA) 반응, nanofluidic PCR에 의한 대상의 수백 qPCR을 허용합니다. 어느 이러한 방식을 사용하여, 그것은 세포 사이의 표현의 다양성뿐만 아니라, 조직 내에서 드문 세포 유형의 표현 프로필을 검토을 검토하는 것이 가능합니다. 전반적으로, 단일 세포 유전자 표현 방식은 잠재적으로 전체 조직에서 생성된 전형적인 homogenates의 세포 수백만의 표현을 조사했을 때 일반적으로 밖으로 평균 아르 특이한 표현 프로파일을 식별할 수있는 데이터의 생성을 허용합니다.
이 메서드는 기능의 숫자뿐만 아니라 유전자 발현 연구에 대한 cardiomyocytes를 생성할 수있는 가능성이 있습니다. 단일 세포의 검사는 유전자 발현 분석에 급성장 지역입니다. 단일 세포 수준에서 transcriptional 수준을 검토의 장점은 전체 조직의 준비에서 가능하지 않은 순수한 세포 인구의 시험을 허용한다는 것입니다. 또한, 단일 세포 분석은 이전에 균질 8,9 것으로 생각되었다 세포 인구를 정의하는 각각의 세포에서 mRNA 수준의 확률적 변화의 시험을 수 있습니다. 자신의 유전자 표현 10,11,12에 잠재적으로 확률적 아르 유전자를 식별하는 이외에 방법은 또한 유전자 발현 프로파일에 의해 정의된 희귀 세포 집단의 식별을 허용합니다.
이 방법은 유전자 발현 분석에 흥미로운 가능성이 사용하는 다수의를 제공하고 있지만, som있다단일 세포의 사용에 전자주의 사항 및 고려 사항. 단일 세포 분석에 기본 제한은, 예를 들어 분산에 대한 관심의 메트 릭에 관련하여 통계적 중요성을 달성하기 위해 실험에서 충분한 세포의 모음입니다. 관심의 조직으로부터 격리 세포의 숫자가 제한되지 않습니다 경우에, 하나는 같은 차세대 시퀀싱, 또는 nanofluidic 배열과 같은 접근법을 사용하여 그룹 당 세포의 수백을 확인하실 수 있습니다. 하지만 일부 경우에, 관심의 조직에서 충분한 세포를 얻기에 어려움이있을 수 있습니다. 이 부분에서 대상 셀 형식의 컬렉션에 대한 특이한 시간 집중 과정으로 인해 발생할 수 있습니다. 그러나, 단일 셀 컬렉션을 진행하기 위해 신중 계획과 사전 준비는 여전히 제한된 기술 오류와 함께 엄격한 단일 세포 분석을 위해 허용할 수 있습니다. 그것이 고려되어야 그 결과를 검토하면, 세포 분리에 대해이 절차는 여러 studie에 사용되었습니다 비록 그s이 (현미경, 전기 생리학, 등), 격리 자체는 잠재적으로 유전자 발현에 영향을 수 있습니다. 생물 학적 샘플을 조작하는 방법과 마찬가지로, 당신의 결과의 결과를주의 깊게 단세포 표현은 조직 자체 기술하지 편견 대표하기 위해 검증해야합니다. 이러한 현장 하이브 리다이 제이션에서와 같이 방법은 손상 조직에서 이러한 결과를 확인하기 위해 유용합니다. 마지막으로, 그것은 생성된 데이터가 신중하게 품질 관리를위한 체크되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그림 8에 표시된 데이터는 qPCR의 assays 이러한 분석 # 13 (A13)와 같은, 그들의 특이성이 매우 강력한하거나 그러한 분석 # 34 (A34)와 같은 기술적인 변화로 이어질 수있는 다양성의 높은 수준을 가지고 수 있습니다 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는이 프로토콜의 촬영 기간 동안 C. Zambataro의 기술 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 기꺼이 글렌 네이선 충격 센터 상을 의학 연구 (SM), Hillblom 재단과 국립 보건원에 대한 재단 (P30AG025708)와 PO1AG025901의 지원을 인정합니다. JMF는 노화 연구에 대한 책임 연구원에게 수여 T32AG000266에 의해 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Collagenase, Type I | Worthington | C9891 | |
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, | PN T0221 | |
BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein Vet. Supply* | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
ExoSAP IT | Affymetrix/USB | 78201 | |
CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent | 7500 kit | |
One Color Labeling kit | Roche-NimbleGen | 5223555001 | |
Mus Musculus 12x135k array | Roche-NimbleGen | 5543797001 | |
GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |