وحيد الخلية التنميط التعبير يسمح التعبير الجيني التحليل التفصيلي الخلايا الفردية. نحن تصف طرق لعزل الخلايا العضلية ، وإعداد lysates الناتجة إما كليا أو ميكروأري transcriptome qPCR أهداف محددة.
في حين أن العديد من الدراسات قد درست التغييرات التعبير الجيني من الخليط من أنسجة القلب ، وهذا يحول دون دراسة الاختلاف بين الخلايا العشوائية الكامنة داخل الأنسجة. عزل السكان cardiomyocyte نقية من خلال نضح كولاجيناز قلوب الماوس يسهل جيل من خلية واحدة لميكروأرس كله transcriptome التعبير الجيني ، أو qPCR أهداف محددة باستخدام صفائف nanofluidic. نحن هنا وصف لإجراء فحص واحد ملامح التعبير الجيني للخلايا العضلية معزولة من القلب. هذا النموذج يسمح لتقييم مقاييس المصالح التي لا تعتمد على الوسط (على سبيل المثال الفرق بين الخلايا داخل الأنسجة) التي هي غير ممكنة عند استخدام الأنسجة التقليدية سير العمل كله لتقييم التعبير الجيني (الشكل 1). حققنا التضخيم القوي للميكروغرام خلية واحدة transcriptome العائد من [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل المزدوج الذي يسهل استخدام ميكروأرس على طndividual الخلايا. في إجراء وصفنا استخدام صفائف NimbleGen التي تم اختيارها لسهولة استخدامها والقدرة على تخصيص تصميمها. بدلا من ذلك ، والناسخ العكسي — التضخيم محددة الهدف (RT – STA) رد فعل ، ويسمح لqPCR مئات الأهداف التي nanofluidic PCR. باستخدام أي من هذه الأساليب ، فمن الممكن لدراسة التباين في التعبير بين الخلايا ، وكذلك دراسة ملامح التعبير من أنواع الخلايا نادرة من داخل الأنسجة. عموما ، هذا الجين التعبير عن خلية واحدة النهج يسمح لتوليد البيانات التي يمكن أن تحدد ملامح التعبير الفقهي يحتمل أن متوسط عادة عند دراسة أصل التعبير عن ملايين الخلايا من الخليط النموذجية الناتجة من الأنسجة كلها.
هذا الأسلوب لديه إمكانية لتوليد العضلية لعدد من وظيفية فضلا عن دراسات التعبير الجيني. فحص الخلايا واحدة هي منطقة مزدهرة في تحليل التعبير الجيني. في الاستفادة من فحص مستويات النسخي على مستوى الخلية واحد هو الذي يسمح للفحص من السكان الخلية نقية ، وهي ليست ممكنة من التحضيرات النسيج كله. بالإضافة إلى ذلك ، واحد خلية التحليل يسمح لدراسة تباين مستويات العشوائية مرنا في الخلايا الفردية لتعريف السكان الخلية التي كان يعتقد في السابق أن يكون 8،9 متجانسة. بالإضافة إلى تحديد الجينات التي يحتمل العشوائية في التعبير الجيني على 10،11،12 ، الأسلوب يسمح أيضا لتحديد هوية السكان الخلية نادرة تعرف من خلال ملفاتهم التعبير الجيني.
في حين أن هذا الأسلوب يوفر عددا من الاستخدامات المحتملة مثيرة في تحليل التعبير الجيني ، وهناك سومه المحاذير والاعتبارات في استخدام الخلايا واحدة. القيد الأولية لتحليل خلية واحدة ، هو جمع ما يكفي من الخلايا في التجربة لتحقيق دلالة إحصائية فيما يتعلق متري من الاهتمام ، على سبيل المثال الفرق. في الحالات التي يكون فيها عدد خلايا معزولة عن الأنسجة من الاهتمام ليس الحصر ، يمكن للمرء أن دراسة مئات من الخلايا لكل مجموعة ، وذلك باستخدام أساليب مثل الجيل المقبل من التسلسل ، أو صفائف nanofluidic. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون هناك صعوبة في الحصول على ما يكفي من الخلايا من الأنسجة من الاهتمام. يمكن أن يكون هذا في جزء منه بسبب الإجراءات وقت الفقهي مكثفة لجمع نوع من الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، قد التخطيط الدقيق والإعداد قبل الشروع في جمع خلية واحدة لا تزال تسمح لصرامة التحليل خلية واحدة مع خطأ تقني محدود. عند دراسة النتائج يجب النظر في ذلك ، وهذا حتى ولو تم استخدام هذا الإجراء لعزل الخلايا في العديد من studieق (بما في ذلك الفحص المجهري ، الكهربية ، الخ) ، يمكن عزل نفسها تأثير يحتمل التعبير الجيني. كما هو الحال مع أي الطريقة التي تعالج العينات البيولوجية ، ينبغي أن تكون النتائج التي توصلت الخاص التحقق بعناية من أجل ضمان التعبير خلية واحدة هو ممثل النسيج نفسه ، وليس التحيز التقنية. قد طرق مثل تهجين في الموضع الطبيعي أن تكون مفيدة للتحقق من هذه النتائج في أنسجة سليمة. أخيرا ، من الأهمية بمكان لضمان أن يتم التحقق بعناية البيانات التي تم إنشاؤها لمراقبة الجودة. البيانات التي تظهر في الشكل 8 يدل على أن المقايسات qPCR قد تكون قوية جدا في خصوصيتها ، مثل مقايسة # 13 (A13) أو لديهم مستوى عال من التباين الذي يمكن أن يؤدي إلى الفرق الفنية مثل مقايسة # 34 (A34).
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أن نعترف المساعدة التقنية من Zambataro جيم أثناء تصوير هذا البروتوكول. نحن نعترف بامتنان بدعم من مؤسسة جلين للأبحاث الطبية (SM) ، ومؤسسة Hillblom ، والمعاهد الوطنية للصحة لمركز ناثان جائزة صدمة (P30AG025708) وPO1AG025901. كان مدعوما من قبل JMF T32AG000266 منحت لمعهد باك لبحوث الشيخوخة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Collagenase, Type I | Worthington | C9891 | |
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, | PN T0221 | |
BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein Vet. Supply* | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
ExoSAP IT | Affymetrix/USB | 78201 | |
CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent | 7500 kit | |
One Color Labeling kit | Roche-NimbleGen | 5223555001 | |
Mus Musculus 12x135k array | Roche-NimbleGen | 5543797001 | |
GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |