JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67076
, , , , , ,
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience,Delft University of Technology, 2Chromosome Replication Laboratory,Francis Crick Institute, 3Department of Physics and Kavli Institute of Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Abstract

Ökaryotlar, replizomu merkezi olarak organize eden ve süren ve replikasyon çatallarının önünde yol gösteren CMG olarak bilinen bir replikatif helikaza sahiptir. CMG’nin dinamikleri hakkında derin bir mekanik anlayış elde etmek, hücrelerin tüm genomlarını hücre döngüsü başına bir kez verimli ve doğru bir şekilde çoğaltma gibi muazzam bir görevi nasıl başardıklarını aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Tek moleküllü teknikler, benzersiz zamansal ve uzamsal çözünürlükleri nedeniyle CMG’nin dinamiklerini ölçmek için benzersiz bir şekilde uygundur. Bununla birlikte, CMG hareketinin tek moleküllü çalışmaları, şimdiye kadar, hücrelerden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden oluşturulmuş CMG’ye dayanmıştır, bu da aktivasyonuna yol açan adımların incelenmesini engellemektedir. Burada, 36 farklı saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptitinden montajını ve aktivasyonunu tamamen yeniden oluşturduktan sonra floresan olarak işaretlenmiş CMG’nin hareketinin tek molekül seviyesinde görüntülemeye izin veren hibrit bir topluluk ve tek moleküllü testi tarif ediyoruz. Bu tahlil, iki ortogonal bağlanma parçasına sahip doğrusal bir DNA substratının uçlarının çift işlevselleştirilmesine dayanır ve tek molekül düzeyinde benzer şekilde karmaşık DNA işleme mekanizmalarını incelemek için uyarlanabilir.

Introduction

Ökaryotlarda DNA replikasyonu, replisome1 olarak bilinen dinamik bir protein kompleksi tarafından gerçekleştirilir. Bu kompleksin önemli bir bileşeni, replizomu süren ve merkezi olarak organize eden, replikasyon çatallarının 1,2 önünde yol gösteren ökaryotik replikatif sarmal Cdc45/Mcm2-7/GINS’dir (CMG). Bu nedenle, CMG’nin dinamikleri hakkında derin bir nicel anlayış elde etmek, yanıtın dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir. Böyle bir anlayış, eşsiz uzamsal ve zamansal çözünürlükleri nedeniyle CMG gibi moleküler motorları incelemek için benzersiz bir şekilde uygun olan tek moleküllü tekniklerle elde edilebilir ve bize işlevleri, stokastiklikleri ve dinamikleri hakkında benzersiz bir nicel anlayış sağlayabilir 2,3,4,5,6,7,8,9.

İn vivo, CMG, replikasyonun hücre döngüsü 1,10,11 başına yalnızca bir kez gerçekleşmesini sağlamak için zamansal olarak ayrılmış bir şekilde yüklenir ve aktive edilir. İlk olarak, hücre döngüsünün G1 fazında, yükleme faktörleri olarak bilinen bir dizi protein, CMG’nin ilk bileşeni olan Mcm2-7 heksamerik kompleksini, kafa kafaya konfigürasyona sahip çift heksamer şeklinde dsDNA 12,13,14,15,16 üzerine yükler 15,17,18 . Maya spesifik durumunda, bu ilk işlem, replikasyon1’in kökenleri olarak bilinen spesifik DNA dizilerinde meydana gelir. Mcm2-7, replikatif helikazın motor çekirdeği olmasına rağmen, tam aktif CMG11,19,20,21’e yol açmak için yüklü Mcm2-7’ye alınması gereken iki helikaz aktive edici faktör Cdc45 ve GINS olmadan kendi başına DNA 19’u çözemez. Helikaz aktivasyon süreci, hücre döngüsünün S fazında gerçekleşir ve hücre döngüsü tarafından düzenlenen kinaz DDK 22,23,24 tarafından Mcm2-7 çift heksamerlerinin seçici fosforilasyonu ile başlar. Bu fosforilasyon olayları, Cdc45 ve GINS’in, ateşleme faktörleri10,11,26 olarak bilinen ikinci bir protein seti tarafından Mcm2-7 çift heksamerlere 10,22,23,24,25,26 alınmasını kolaylaştırır . Cdc45 ve GINS’in bağlanması, başlangıçta ebeveyn DNA’sının her iki zincirini de çevreleyen ve hala kafa kafaya bir konfigürasyonda bulunan iki kardeş CMG helikazınayol açar 11,27. Son aktivasyon adımında, ateşleme faktörü Mcm10, her bir kardeş CMG11’den bir DNA zincirinin ATP hidrolizine bağlı ekstrüzyonunu katalize eder. İplik ekstrüzyonundan sonra, kardeş CMG helikazları, ATP hidrolizine bağımlı bir şekilde 11,20,21,28 ssDNA boyunca yer değiştirerek birbirinden baypas eder ve ayrılır, translokasyon olmayan iplik29’u sterik olarak dışlayarak DNA’yı çözer. Tüm bu süreç, minimal 36 saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptit10,11 setinden in vitro olarak tamamen yeniden oluşturulmuştur.

Yukarıda tarif edilen CMG montajının ve aktivasyonunun mükemmel in vivo regülasyonuna rağmen, CMG 2,30,31,32,33,34’ün in vitro olarak yeniden yapılandırılmış tek moleküllü hareket çalışmaları, şimdiye kadar20,21 hücrelerinden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden aktive edilmiş CMG’ye dayanmıştır, aktivasyonundan önceki tüm adımları ve hareketinin çift yönlü doğasını kaçırıyor. Bu önceden aktive edilmiş CMG yaklaşımı, kısmen tamamen yeniden yapılandırılmış CMG montaj reaksiyonunun10,11 biyokimyasal karmaşıklığı nedeniyle tek moleküllü alanda altın standart olmuştur. Bu biyokimyasal reaksiyonun, çeşitli nedenlerden dolayı toplu biyokimyasal seviyeden tek molekül seviyesine çevrilmesi zor olmuştur. İlk olarak, reaksiyon verimlerini en üst düzeye çıkarmak için, CMG montajı ve aktivasyonu için gerekli olan yükleme ve ateşleme faktörleri 10-200 nM 10,11,27 aralığındaki konsantrasyonlarda gereklidir. Bu konsantrasyon aralıkları, özellikle floresan etiketli bileşenler35 kullanıldığında, çoğu tek moleküllü tekniğin tolere edebileceğinin en üst sınırına karşılık gelir. Son olarak, CMG, 36,37,38,39 hücresindeki binlerce baz çifti arasında gezinmek için evrimleşmiştir. Bu nedenle, hareketini biyolojik olarak ilgili bir uzamsal ölçekte incelemek için, uzun DNA substratları (tipik olarak onlarca kilobaz mertebesinde uzunluklarda) gerekir.30,31,34,40,41,42. Bu kadar uzun DNA substratlarının kullanılması, DNA substratı ne kadar uzunsa, proteinler ve protein agregatları için o kadar fazla potansiyel spesifik olmayan bağlanma bölgesi gibi ek bir zorluk teşkil eder. CMG söz konusu olduğunda, CMG montajı ve aktivasyonunda yer alan yükleme ve ateşleme faktörlerinin birçoğu içsel olarak düzensiz bölgeler43 içerdiğinden ve toplanmaya eğilimli olduğundan, ikinci nokta özellikle önemlidir.

Burada, 36 saflaştırılmış S. cerevisiae polipeptit28’den montajını ve aktivasyonunu tamamen yeniden oluşturduktan sonra CMG’nin hareketinin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz. Bu tahlil, bir DNA substratının her iki ucunun iki ortogonal bağlanma parçası ile çift işlevselleştirilmesine dayanır: desthiobiotin ve digoksigenin2 (Şekil 1A). İlk kısım olan desthiobiotin, DNA substratını streptavidin kaplı manyetik boncuklara44 geri dönüşümlü olarak bağlamak için kullanılır (Şekil 1B). Bunu takiben, floresan etiketli CMG, boncuk bağlı DNA üzerine monte edilir ve aktive edilir ve elde edilen manyetik boncuk bağlı DNA: CMG komplekslerini saflaştırmak ve yıkamak için manyetik bir raf kullanılır (Şekil 1C). Bunu yaparken, aksi takdirde DNA substratı üzerinde toplanacak olan fazla protein uzaklaştırılır; bu, neredeyse agregasyonsuz DNA: CMG kompleksleri sağlar. Sağlam kompleksler daha sonra, desthiobiotin-streptavidin etkileşimini geride bırakabilen bir molar fazla serbest biotin ilavesiyle manyetik boncuklardan ayrıştırılır (Şekil 1D). Bireysel DNA: CMG kompleksleri daha sonra anti-digoksigenin antikoru (anti-Dig) ile kaplanmış optik olarak hapsedilmiş iki polistiren boncuk arasına bağlanır; bu adım için, DNA üzerindeki ikinci kısım olan digoksigenin, fazla miktarda serbest biyotin içeren bir tampon çözeltisinde bile anti-Dig’e bağlanabildiği için kullanılır (Şekil 1E). DNA: CMG kompleksi optik tuzakta yerinde tutulduktan sonra, floresan etiketli CMG’nin hareketi bir konfokal tarama lazeri ile görüntülenir (Şekil 1F). Bu tahlilin, benzer şekilde karmaşık DNA: protein etkileşimlerinin tek molekül düzeyinde çalışma için kolayca uyarlanabileceğini tahmin ediyoruz.

Protocol

1. Çift işlevselleştirilmiş lineer DNA substratının sentezi ve manyetik boncuklara bağlanması DNA substratının desthiobiotin ve digoksigenin kısımları ile ikili işlevselleştirilmesi20 μg 23.6 kb plazmid pGL50-ARS1’i (doğal bir ARS1 replikasyon kaynağı içeren, evde klonlanmış ve istek üzerine temin edilebilir) 200 μL 1x tampon (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat) nihai hacimde 37 ° C’de 16 saat boyunca doğrusallaştırın. 100 μg/ml BSA, pH 7.9).NOT: Bu adım, daha uygunsa, verimi düşürmeden 4 saate düşürülebilir. Reaksiyonu 65 ° C’de 20 dakika inkübe ederek AflII’yi inaktive edin. 200 μL’lik doğrusallaştırma reaksiyonunu 60 birim Klenow Fragment (3′ ila 5′ ekzo-) polimeraz, 17 μL 10x tampon (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7.9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, ve 370 μM’lik bir nihai hacme kadar ultra saf su. Reaksiyonu 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin.NOT: Bu adımda, Klenow Parçası, her iki uçta iki D-Desthiobiotin-7-dATP ve iki Digoxigenin-11-dUTP nükleotidi ekleyerek doğrusallaştırılmış DNA’nın her iki ucundaki çıkıntıları köreltir. Reaksiyonu 10 mM EDTA ile destekleyin ve reaksiyonu 75 ° C’de 20 dakika inkübe ederek Klenow Fragmanını inaktive edin. Ultra saf su ile reaksiyon hacmini 400 μL’ye getirin. Dört S-400 döndürme sütunu alın, reçineyi yeniden süspanse etmek için en az 30 saniye vorteksleyin ve ardından depolama tamponunu çıkarmak için 735 x g’da 1 dakika santrifüjleyin. 1,5 mL’lik tüpleri temizlemek için sütunları aktarın. Hemen, her sütuna 100 μL DNA çözeltisi ekleyin ve bunları 735 x g’da 2 dakika santrifüjleyin. DNA şimdi akış halindedir ve sütunlar atılabilir. Dört sütunun akışını bir araya getirin, hacmi bir pipetle ölçün ve DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bu, boncuklara bağlı DNA miktarını hesaplamak için kullanılacaktır. Streptavidin kaplı manyetik boncuklara iki kat işlevselleştirilmiş lineer DNA’nın bağlanmasıM-280 streptavidin kaplı manyetik boncukları 30 saniye boyunca yeniden süspanse etmek için vorteks. 4 mg yeniden süspanse edilmiş M-280 streptavidin kaplı manyetik boncukları temiz bir 1.5 mL tüpe aktarın. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların toplanması için 1 dakika bekleyin ve saklama tamponunu çıkarın. Boncuklara 1 mL 1x tampon A (5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA ve 1 M NaCl) ekleyin ve 5 saniye boyunca girdaplama ile yeniden süspanse edin. Boncukları oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.NOT: Tüm tamponlar steril filtreli olmalıdır. Zaman kazanmak için önceden 2x tampon A, 1x tampon B (aşağıya bakın) ve 1x tampon C (aşağıya bakın) büyük miktarda yapın (önerilir). Bu tamponlar, manyetik boncuk üreticisi tarafından tavsiye edilen tamponlardır ve – 20 ° C’de saklanabilir. Tüpü manyetik bir tutucuya yerleştirin, boncukların toplanması için 1 dakika bekleyin ve tampon A’yı çıkarın. Boncukları pipetleme yoluyla 400 μL 2x tampon A içinde yeniden süspanse edin ve ardından 400 μL işlevselleştirilmiş DNA çözeltisi ekleyin (bunun 2x tampon A’yı, DNA’nın boncuklara bağlanması için en uygun olan 1x’lik bir nihai konsantrasyona seyrelttiğini unutmayın). Pipetleme ile nazikçe karıştırın. İşlevselleştirilmiş DNA’nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için boncuk/DNA karışımını gece boyunca 4 °C’de uçtan uca dönüşle inkübe edin. Süpernatanı çıkarmak için manyetik rafı kullanın (hacmini bir pipetle ve bağlanmamış DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçmeden önce atmayın) ve boncukları 2x 500 μL tampon B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA ve 1 M KOAc) ile yıkayın spesifik olarak bağlanmamış DNA’yı çıkarmak için. Boncukları 2x, üretici tarafından önerilen saklama tamponu olan 500 μL tampon C (10 mM HEPES-KOH pH 7.6 ve 1 mM EDTA) ile yıkayın.Boncuklara eklenen toplam DNA miktarını süpernatantta kalan DNA miktarı ile karşılaştırarak manyetik boncuklara bağlı toplam DNA miktarını hesaplayın. Verim, mg manyetik boncuk başına 2.3-2.9 mg DNA (~ 150-190 fmol) aralığında olmalıdır. Daha düşük verim elde edilirse, kullanmadan önce S400 kolonlarının kuru olmadığını kontrol edin. İlk plazmit DNA substratının bozulmadığından emin olmak için jel elektroforezi ile DNA bütünlüğünü sürekli olarak izleyin. Boncukları 300 μL tampon C’de tekrar süspanse edin ve 4 °C’de saklayın. Çentiklenmeyi önlemek için, 1 mg manyetik boncuktan 4 adet tek kullanımlık alikot yapın ve DNA’yı 2 haftadan daha uzun süre saklamayın. 2. Korelasyonlu çift ışınlı optik cımbız ve konfokal mikroskopi ile tamamen yeniden yapılandırılmış CMG’nin hareketini görüntülemek ve ölçmek için hibrit topluluk ve tek moleküllü test Floresan etiketli CMG’nin manyetik boncuk bağlı DNA (Şekil 1C).NOT: CMG montajı ve aktivasyon reaksiyonları iki aşamada gerçekleştirilmiştir: Mcm2-7 yükleme ve fosforilasyon ve CMG montajı ve aktivasyonu. Aksi belirtilmedikçe, tüm tampon değişim adımları, boncukların mıknatıs tarafından 1 dakika boyunca toplanmasına izin verilerek ve ardından süpernatantın çıkarılmasıyla manyetik bir raf yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Tüm inkübasyonlar, floresan proteinlerin foto-ağartılmasını önlemek için kapaklı, sıcaklık kontrollü bir ısı bloğunda gerçekleştirildi. Kapak yoksa, tüpler kalay folyo ile kaplanmalıdır. Bu protokolde kullanılan tüm proteinlerin saflaştırılması ve floresan etiketlemesi daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir10,11,28.Mcm2-7 yükleme ve fosforilasyon1 mg DNA’ya bağlı streptavidin kaplı manyetik boncuklar alın ve depolama tamponunu (tampon C) çıkarın. Boncukları 200 μL yükleme tamponu ile yıkayın (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, gliserol, 2 mM DTT, 100 μg/mL BSA ve 5 mM ATP). Yükleme tamponunu çıkarın ve boncukları 75 μL yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın. Boncuk bağlı DNA’ya 37.5 nM’lik bir nihai konsantrasyonda ORC ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C’de 5 dakika inkübe edin. 50 nM’lik bir nihai konsantrasyonda Cdc6 ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C’de 5 dakika inkübe edin. 100 nM’lik bir nihai konsantrasyonda Mcm2-7 / Cdt1 (veya floresan etiketli Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3 / Cdt1) ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C’de 20 dakika inkübe edin. 100 nM’lik bir nihai konsantrasyonda DDK ekleyin ve reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve boncuk bağlı DNA’yı (şimdi fosforile Mcm2-7 heksamer içerir) 200 μL yüksek tuzlu yıkama (HSW) tamponu (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, gliserol, 1 mM DTT ve 400 μg/mL BSA) ile yıkayın. Pipetleme ile karıştırın, boncukların tamponda tamamen yeniden asılı kaldığından ve hiçbir topak görünmediğinden emin olun. HSW tamponunu çıkarın ve boncukları 200 μL CMG tamponu (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, %0.02 NP40 ikamesi, gliserol, 1 mM DTT ve 400 μg/mL BSA) ile yıkayın. Floresan etiketli CMG’nin montajı ve aktivasyonuCMG tamponunu çıkarın ve DNA’ya bağlı boncukları 5 mM ATP ile desteklenmiş 50 μL CMG tamponunda yeniden süspanse edin. Boncuk bağlı DNA’ya 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3 / 7, 55 nM Sld2 ve 10 nM Mcm10 ekleyin. Bu adım için, tüm proteinleri DNA’ya eklemeden hemen önce bir tüpte karıştırın ve buzun üzerine yerleştirin. Yeniden askıya alınmış boncuk bağlı DNA’yı protein karışımına ekleyin. Reaksiyonu 800 rpm çalkalama ile 30 ° C’de 15 dakika inkübe edin. Boncukları 3x 200 μL HSW tamponu ile yıkayın. Boncukları 200 μL CMG tamponu ile bir kez yıkayın. Bozulmamış DNA’nın elüsyonu: Manyetik boncuklardan CMG kompleksleri (Şekil 1D)CMG tamponunu çıkarın ve DNA’yı elüte edin: CMG içeren DNA’ya bağlı manyetik boncukları 200 μL elüsyon tamponunda (10 mM biotin ile desteklenmiş CMG tamponu) yeniden süspanse ederek manyetik boncuklardan CMG kompleksleri. 800 rpm çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca toplanmasına izin verin. Çökelmiş boncukları bozmadan süpernatanı (şimdi ayrıştırılmış DNA: CMG komplekslerini içeren) dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Çözeltide boncuk kalmadığından emin olmak için (çözelti içinde bırakılan manyetik boncuklar testin optik yakalama kısmına müdahale edebileceğinden), toplanan süpernatanı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve kalan boncukların 5 dakika daha toplanmasına izin verin. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. 200 μL süpernatanıma 1400 μL CMG tamponu ekleyin. Numune artık tek moleküllü görüntüleme için hazırdır. Tam sulandırılmış CMG’nin korelasyonlu çift ışınlı optik cımbız ve konfokal mikroskopi ile tek moleküllü görüntülenmesi (Şekil 1E-G).NOT: Testin tek moleküllü kısmı, çift ışınlı optik cımbızları konfokal mikroskopi ve mikroakışkanlarla birleştiren ticari bir kurulumda gerçekleştirilir45,46 (Şekil 1E-G), ancak ev yapımı bir kurulumda da gerçekleştirilebilir. Burada kullanılan ticari kurulum, beş girişe (sırasıyla Kanal 1-5 olarak anılır) ve bir çıkışa (Şekil 1E). Aşağıdaki adımlarda, tüm düğme ve/veya panel adları, bu ticari kurulumla birlikte sağlanan yazılıma özeldir.Ticari kurulumdaki beş girişi aşağıdaki gibi kullanın: Kanal 1-3’ü soldan enjekte edin ve bunları boncuk yakalama (Kanal 1), DNA-protein kompleksi bağlama (Kanal 2) ve CMG’nin varlığını kontrol etme (Kanal 3) için kullanın. Kanal 4 ve 5’i protein rezervuarları ve tampon değişim yerleri olarak kullanın. Her deneyden önce, mikroakışkan akış hücresini 1 mg / mL sığır serum albümini ile en az 30 dakika pasifleştirin, ardından ultra saf suda çözülmüş% 0.5 Pluronic F-127 ile pasifleştirin.Her deneydeki her kanalın içeriğinin açıklandığı gibi olduğundan emin olun (Şekil 1E):Kanal 1: PBS’de 1:50 oranında seyreltilmiş anti-digoksigenin kaplı polistiren boncuklar (2.06 μm çapında);Kanal 2: DNA: Manyetik boncuklardan ayrıştırılan CMG kompleksleri;Kanal 3: Görüntüleme Tamponu (2 mM 1,3,5,7 siklooktatetraen, 2 mM 4-nitrobenzilalkohol ve 2 mM Trolox ile desteklenmiş CMG tamponu);Kanal 4 ve 5: 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 ve 5 mM ATP, 5 mM ATPγS ile desteklenmiş veya nükleotid içermeyen Görüntüleme Tamponu. Deneyden önce, yazılımın Güç Kontrolleri panelindeki Yeniden Kalibre Et düğmesine tıklayarak her iki tuzaktada 0.3 pN/nm sertlik elde etmek için yakalama lazer gücünü 33,46 ayarlayın. Yazılımın Görüntü Tarama panelinde eş odaklı piksel boyutunu 50 x 50 nm, görüntü boyutunu 160 x 18 piksel, piksel başına aydınlatma süresini 0,2 ms ve kare hızını 5 saniye olarak ayarlayın. Sıcaklık panelinde sıcaklık kontrolünü 30 °C’ye ayarlayın.NOT: Ek olarak, sürükleme kuvveti ile CMG’nin DNA’dan ayrışmasını en aza indirmek için maksimum aşama hızını (kanallar arasında hareket etmek için kullanılır) 0,2 mm/sn’ye ayarlamanızı öneririz. Tüm çözeltileri, enjeksiyon portunda 0,5 bar’lık sabit bir basınçla akış hücresine aktarın (bu, yazılımın Basınç Çubuğu panelinde ayarlanabilir). Ardından, 4. ve 5. kanallardaki akışı kapatın. Başlangıçta tüm çözeltileri akıttıktan sonra, basıncı 0,2 bar’a düşürün. Her optik tuzağa bir boncuk yakalanana kadar yakalama lazerlerini Kanal 1’e taşıyın. Tetiğe basarken joystick’i hareket ettirerek sıkışan boncukları Kanal 2’ye taşıyın. Ardından, tetiğe basmadan joystick’i kullanarak sağ boncuğu sol boncuğa doğru ve sol boncuktan uzaklaştırarak, bir DNA bağı sıkışana kadar bir DNA:CMG kompleksi avlayın (bu, yazılımın FD Viewer panelinde sıkışmış DNA47’nin kuvvet uzatma eğrisinin izlenmesiyle bilinir).DNA bağlantısı için, FD Viewer panelinde DNA yapısının teorik olarak genişletilebilir solucan benzeri bir zincir modelini otomatik olarak çizecek olan Referans Model paneline DNA uzunluğunu ve doğru sıcaklık değerini girdiğinizden emin olun. İki boncuk arasında tek bir DNA molekülü yakalanırsa, DNA’nın kuvvet uzama davranışı, çizilen uzayabilir solucan benzeri zincir modeliyle yakından eşleşmelidir. Yazılımın otomatik olarak teorik olanın üzerine çizeceği deneysel kuvvet-uzama eğrisini izleyerek durumun böyle olduğundan emin olun.NOT: Teorik modelden sapmalar, boncuklar arasına bağlı çoklu DNA moleküllerinin varlığını ve/veya DNA’ya bağlı ve onu sıkıştıran protein agregatlarının varlığını gösterebilir. Proteinlerin DNA’dan kuvvet aracılı ayrışmasını önlemek için, bu ilk test sırasında 10 pN’lik bir gerilimi aşmayın. Boncukları Kanal 3’e taşıyın ve tüm kanallardaki akışı hemen durdurun. Objektifte ölçüldüğü gibi 3 μW gücünde 561 nm lazerle aydınlatan CMG’nin varlığını doğrulamak için Kanal 4’te tek karelik bir test taraması yapın. Uyarma lazerleri panelinde görüntüleme lazer güçlerini ayarlayın. Varsa, CMG, Şekil 1G ve Şekil 2A’da gösterildiği gibi iki boyutlu kırınım sınırlı noktalar olarak görünecektir.DNA yakalanamazsa, kanal 2’deki akışı yavaşlatabilecek kabarcıklar için kanal 2’yi kontrol edin (kanal 1 ve 3’e kıyasla). Kabarcıklar varsa, kabarcıkları akıtmaya çalışmak için kanal 2’deki basıncı 1 bar’a yükseltin. CMG varsa, görüntüleme için DNA bağını kanal 4 veya 5’e taşıyın; Aksi takdirde, akışı tekrar açın, boncukları atın ve Adım 2.2.4’e geri dönün. 4. veya 5. kanallarda, DNA bağında 2 pN’lik bir başlangıç gerilimi elde etmek için boncuklar arasındaki mesafeyi ayarlayın. Bunun için Kuvvet Spektroskopisi paneline 2 pN girin ve bir kuvvet kelepçesi başlatmak için Etkinleştir düğmesine tıklayın. İlk gerilim 2 pN’ye ulaştığında, Kuvvet Spektroskopisi panelindeki Etkinleştir düğmesine tıklayarak görüntülemeden önce kuvvet kelepçesini devre dışı bırakın. Görüntü CMGCdc45-LD555, objektifte ölçüldüğü gibi 4 μW gücünde 561 nm lazerle her 5 saniyede bir (Şekil 1F). Bunun için Image scan (Görüntü taraması) panelindeki Start Scan (Taramayı Başlat) düğmesine tıklayın. Bu tür taramalarda CMG, Şekil 1G’deki örnekte olduğu gibi iki boyutlu kırınım sınırlı noktalar olarak gösterilecektir.CMG gözlenirse ancak ağartmadan önce hareket etmiyor gibi görünüyorsa, nükleaz aktivitesi için kullanılan tüm proteinleri test edin, çünkü DNA üzerindeki çentikler CMG’nin DNA41’den ayrılmasına neden olarak görünür işlemselliğini ciddi şekilde azaltır.NOT: Burada kullanılan ticari mikroskop kullanılıyorsa, 4 μW’lık bir lazer gücü tutarlı sonuçlar vermelidir. Ev yapımı bir kurulum kullanıyorsanız, optimum lazer gücünü ampirik olarak tahmin etmenizi öneririz. Optimal bir lazer gücü, florofordan istenen hassasiyetle lokalize etmek için yeterli sinyal vermeli ve deneyin istenen zaman aralığına yakın bir florofor ömrü vermelidir.NOT: Bu yayın, hibrit topluluk ve tek moleküllü teste odaklansa da, daha önce bu testle oluşturulan verilerin analizinin kapsamlı bir açıklamasını yayınlamıştık48.

Representative Results

Doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, burada açıklanan protokol neredeyse agrega içermeyen DNA:CMG kompleksleri vermelidir. Agregasyonsuz bir reaksiyon, mikroakışkan akış hücresindeki kanalların hiçbirini tıkamamalı ve sıkışmış DNA moleküllerini, DNA’yı kırmadan kontur uzunluğunun ‘u içinde uçtan uca bir uzantıya germek mümkün olmalıdır. Tersine, reaksiyonda toplanma varsa, DNA molekülleri bazen agregalar tarafından sıkıştırılabilir ve gerilirse genellikle DNA kırılmasına neden olabilir. Protein agregatlarını tanımanın iyi bir yolu, DNA’nın 2D taramalarına bakmaktır. Topaklanmasız bir reaksiyonda, CMG, Şekil 2A’da gösterilen taramalarda olduğu gibi, DNA’yı seyrek olarak kalabalıklaştıran ayrık, simetrik kırınım sınırlı noktalar olarak görünür. Aksine, agregalar daha az ayrıktır, bazen Şekil 2B’de gösterilen taramalarda olduğu gibi DNA’nın daha büyük bir uzunluğunu dolduran asimetrik lekelerdir. Ayrıca, test başarılı bir şekilde yürütülürse ve saflaştırılmış proteinlerin yüksek saflığı elde edilirse, Şekil 2C’de gösterilen kimografide gözlemlendiği gibi, ATP varlığında CMG’nin uzun menzilli hareketi görülecektir. Şekil 1: Tamamen yeniden yapılandırılmış CMG’nin hareketini görüntülemek ve ölçmek için hibrit topluluk ve tek moleküllü tahlilin resimli açıklaması. (A) Doğal olarak oluşan bir ARS1 replikasyon kökeni içeren 23.6 kb’lık bir doğrusal DNA, her iki uçta desthiobiotin ve digoksigenin kısımları ile iki kat işlevselleştirilmiştir. (B) İki kat işlevselleştirilmiş DNA, destiyobiotin kısımları aracılığıyla streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanır. (C) CMG, fazla bağlanmamış protein ve protein agregatlarını uzaklaştırmak için farklı yıkama adımları dahil edilerek manyetik boncuk bağlı DNA üzerinde kademeli olarak monte edilir ve aktive edilir. (D) Bozulmamış DNA: CMG kompleksleri daha sonra, desthiobiotin-streptavidin etkileşimini geride bırakan fazla miktarda serbest biotin ilavesiyle manyetik boncuklardan ayrıştırılır. (E) Bireysel DNA: CMG kompleksleri, bir mikroakışkan akış hücresi yardımıyla iki anti-digoksijenin kaplı optik olarak hapsedilmiş polistiren boncuk arasına bağlanır. Dig-anti-Dig etkileşiminin biotin-avidin etkileşimlerine dik olduğunu, bu nedenle serbest biotin varlığından etkilenmediğini unutmayın. (F) Optik cımbız tarafından yerinde tutulduktan sonra, DNA: CMG kompleksleri farklı tampon koşullarına aktarılır, burada DNA düzlemi daha sonra CMG’nin zaman içindeki DNA boyunca hareketini görüntülemek için konfokal bir tarama lazeri ile taranır. (G) Üst panel, bir konfokal tarama lazeri ile taranan iki optik olarak hapsolmuş anti-Dig kaplı polistiren boncuk arasında yerinde tutulan bir DNA:CMG kompleksinin bir diyagramını gösterir. Alt panel, optik bir tuzak ile yerinde tutulan bir DNA’ya bağlı CMG’nin örnek bir 2D taramasını gösterir. DNA bu deneylerde etiketlenmemiştir, ancak görüntünün ortasından geçen yatay bir çizgi olarak düşünülebilir. Bu rakam28’den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Başarılı ve başarısız bir deneyden elde edilen veri örnekleri. (A) Agregasyonsuz bir numunede CMG içeren bir DNA’nın örnek 2D taramaları. Her iki taramada da CMG, DNA boyunca seyrek olarak dağılmış simetrik ve ayrık kırınım sınırlı noktalar gösterir. (B) Agregalar içeren bir numunede CMG içeren bir DNA’nın örnek 2D taramaları. Her iki taramada da CMG, DNA’yı kalabalıklaştıran daha az simetrik lekeler oluşturur. (C) ATP varlığında zaman içinde CMG kırınımı sınırlı noktaların DNA üzerindeki konumunu gösteren, CMG komplekslerinin uzun menzilli hareketini gösteren kimografi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kritik adımlar ve önemli reaktif kalite kontrolleri
Testteki kritik adımlar ve biyolojik reaktif kalite kontrolleri burada vurgulanmıştır. İlk olarak, kullanılan proteinlerin saflığı önemlidir, çünkü protein örneklerindeki küçük nükleaz kirleticilerinin bile neden olduğu DNA bozulması verileri olumsuz yönde etkileyecektir. Bunun nedeni, çift ışınlı optik cımbızda yalnızca sağlam (veya kısmen çentikli) DNA moleküllerinin hapsedilebilmesidir. Daha da önemlisi, DNA üzerindeki çentikler CMG’nin41’i ayrıştırmasına neden olacak ve CMG’nin uzun menzilli hareketinin gözlemlenmesini zorlaştıracaktır. Her saflaştırılmış proteinin nükleaz aktivitesi açısından test edilmesinin yanı sıra, çentiklenmenin minimuma indirildiğinden emin olmak için başlangıç plazmid substratının bütünlüğünün sürekli olarak izlenmesini şiddetle tavsiye ederiz. İkinci önemli adım, DNA:CMG komplekslerinin elüsasyonunu takiben manyetik boncukların dikkatli bir şekilde çıkarılmasıdır. Bu adımdaki süpernatant çıkarma, toplanan boncukları bozmamak için yavaşça yapılmalıdır. Optik cımbıza akan numunede manyetik boncuklar bırakılırsa, bunlar genellikle optik olarak sıkışmış polistiren boncuklara çarparak optik tuzaktan kaçmalarına ve veri toplamayı zorlaştırmalarına neden olur. Son olarak, DNA:CMG kompleksleri optik cımbızda dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu amaçla, kuvvet uygulaması CMG’yi DNA’dan ayırabileceğinden, DNA’nın gerginliğini 10 pN’nin üzerine çıkarmamanızı öneririz. Ayrıca, mikroakışkan akış hücresindeki kanallar arasında hareket, ortaya çıkan sürükleme kuvvetlerinin CMG’yi DNA’dan ayırmasını önlemek için mümkün olduğunca yavaş (~ 0.2 mm / s) yapılmalıdır.

Yöntemin modifikasyonları
Testin değiştirilebilecek birkaç adımı vardır. Örneğin, elüsyon verimini önemli ölçüde etkilemeden elüsyon süresinin 60 dakikadan 30 dakikaya düşürülebileceğini gösterdik. Ek olarak, CMG’nin DNA uçlarından yayılmasını önlemek ve genel olarak CMG28’i stabilize etmek için elüsyon tamponunun düşük (1 mM’nin altında) ATP veya ATPγS konsantrasyonu ile desteklenmesini öneririz. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz tampon bileşimleri ve protein konsantrasyonları, önceki topluluk biyokimyasal ve tek moleküllü çalışmada11,18 kullanılanlara dayanmasına rağmen, tanımladığımız tahlil, CMG 26,27’yi birleştirmek için diğer protokollerle tamamen uyumludur. Bu nedenle, CMG montajının veya aktivasyonunun verimliliğini arttırdığı bildirilen herhangi bir biyokimyasal ilerleme, verimi artırmak için testin toplu kısmında uygulanabilir ve uygulanmalıdır. Son olarak, çerçeveler arasındaki sürenin arttırılması, CMG’nin görüntülenebileceği toplam süreyi artırarak, florofor ağartma işleminden önce uzun menzilli CMG hareketinin gözlemlenmesini kolaylaştırır.

Yöntemin sınırlamaları
Tanımladığımız hibrit yöntem, CMG’nin yalnızca toplu olarak etkinleştirilmesinin ardından görüntülenebilmesi bakımından sınırlıdır. CMG’nin aktivasyonunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için daha fazla çalışma gerekecektir. Bir diğer önemli sınırlama, CMG’nin 17,26,27 çiftleri halinde birleştirilmesini beklerken, gözlemlediğimiz DNA başına toplam CMG kompleksi sayısının çoğunlukla bir28 olmasıdır, bu da CMG’nin veya en azından Cdc45’in hassas DNA’nın işlenmesi sırasında DNA’dan ayrıldığını düşündürmektedir: CMG kompleksleri. Tek moleküllü görüntülemeden önce işleme adımlarının sayısının azaltılmasının yanı sıra, mikroakışkan akış hücresinin plastik boruları ve camı için daha iyi pasivasyon stratejileri geliştirmek bu verimi artırmaya hazırdır.

Yöntemin önemi
CMG’nin tek moleküllü hareket çalışmaları, şimdiye kadar hücrelerden bir kompleks olarak saflaştırılmış önceden aktive edilmiş CMG’yi kullanmıştır. Nispeten daha basit olsa da, bu önceden etkinleştirilmiş CMG yaklaşımı, CMG aktivasyonuna yol açan adımların yanı sıra CMG’nin çift yönlü doğasını ve replisome hareketini kaçırması nedeniyle sınırlıdır. Öte yandan, CMG montajının ve aktivasyonunun tam olarak yeniden yapılandırılması, herhangi bir aktivasyon öncesi adımı incelemenin yanı sıra CMG hareketini çift yönlü bir şekilde inceleme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın toplu biyokimyasal seviyeden tek molekül seviyesine çevrilmesi daha zordur, çünkü çok daha fazla saflaştırılmış protein faktörü ve adımı içerir. Burada tanımladığımız tahlil, tek molekül seviyesinde tamamen yeniden yapılandırılmış CMG’nin hareketini görüntülememize izin vererek, daha önce kaçırılan bazı aktivasyon öncesi dinamiklere erişmemize izin vererek bu zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı oldu28. Ek olarak, çoğunlukla DNA başına bir CMG görmemize rağmen, zıt yönlerde hareket eden iki CMG kompleksinin birkaç örneğini gözlemleyebildik ve hatta kardeş CMG’lerin birbirinden ilk ayrılmasını bile yakalayabildik28, bu da çift yönlü replikasyonun kurulmasına dair bazı bilgiler sağladı.

Bu testin önceki CMG hareketine kıyasla bir başka avantajı, kullandığımız DNA substratının tamamen çift sarmallı doğasında yatmaktadır (Şekil 1A). Önceki önceden aktive edilmiş CMG çalışmasında, CMG’yi DNA substratına bağlamanın en yaygın yolu 3′ ssDNA flebidir. Bu, burulma ile kolayca sınırlandırılamayan bir DNA yapısı ile sonuçlanır ve bu nedenle, replisome ilerlemesinde süper sarmanın rolünün araştırılmasını yasaklar. Tersine, burada tanımladığımız yeni yaklaşım, kullanılan DNA substratı tamamen çift sarmallı olduğundan, bu süreçte torkun rolünü incelemek için uyarlanma potansiyeline sahip olabilir.

Yöntemin daha geniş uygulamaları
Açıklanan hibrit tahlil, tam bir ökaryotik yanıtın tam olarak yeniden yapılandırılmasına giden yolu açacak ve bize ve diğerlerine, yanıtlayıcının tüm farklı görevlerinde başarılı olmasını sağlayan önemli dinamikleri gözlemlememize ve ölçmemize olanak tanıyacaktır. DNA replikasyonu bir yana, rapor ettiğimiz tahlil, karmaşık bir biyokimyasal reaksiyonun toplu biyokimyasaldan tek molekül seviyesine çevrilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil ediyor. Bu tahlilin, farklı DNA işleme mekanizmalarında yer alan benzer şekilde karmaşık DNA: protein etkileşimlerini incelemek için kolayca değiştirilebileceğini tahmin ediyoruz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, etiketlenmemiş proteinlerin aşırı ekspresyonu için maya suşları sağladıkları için Anne Early, Lucy Drury ve Max Douglas’a ve ayrıca ND laboratuvar üyeleri Anuj Kumar, Katinka Ligthart ve Julien Gros’a yükleme faktörlerini ve DDK’yı saflaştırmaya yardımcı oldukları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı bilimsel tartışmalar için Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci ve Taekjip Ha’ya teşekkür eder. D.R.M., Boehringer Ingelheim Fonds Doktora Bursu’ndan fon aldığını kabul etti.  ND, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO) En İyi hibe 714.017.002 ve Avrupa Araştırma Konseyi’nden Gelişmiş Hibe (REPLICHROMA; hibe numarası 789267) aracılığıyla fon sağladığını kabul eder.

Materials

AflII  NEB R0520L
Anti-digoxigenin coated polystyrene beads  Spheroteck DIGP-20-2
ATP solution Thermo Fisher R0441
ATPγS Roche 11162306001
BSA NEB B9000S
C-Trap Lumicks
CutSmart Buffer NEB B6004S Provided with AflII
dCTP Promega U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP Jena Bioscience  NU-835-Desthiobio
dGTP Thermo Fisher 10218014
Digoxigenin-11-dUTP Jena Bioscience NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads Invitrogen 11205D
Klenow Fragment (3'→5' exo-)  NEB M0212L
Microspin S-400 HR spin columns  GE Healthcare GE27-5140-01
NEBuffer2 NEB B7002S Provided with Klenow Fragment
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385
Pluronic F-127  Sigma P2443
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase. Nat Commun. 10 (1), 1-14 (2019).
  3. Ticau, S., Friedman, L. J., Ivica, N. A., Gelles, J., Bell, S. P. Single-molecule studies of origin licensing reveal mechanisms ensuring bidirectional helicase loading. Cell. 161 (3), 513-525 (2015).
  4. Ticau, S., et al. Mechanism and timing of Mcm2-7 ring closure during DNA replication origin licensing. Nat Str Mol Biol. 24 (3), 309-315 (2017).
  5. Gupta, S., Friedman, L. J., Gelles, J., Bell, S. P. A helicase- tethered ORC flip enables bidirectional helicase loading. eLife. 10, e74282 (2021).
  6. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).
  7. Dulin, D., Berghuis, B. A., Depken, M., Dekker, N. H. Untangling reaction pathways through modern approaches to high-throughput single-molecule force-spectroscopy experiments. Curr Opinion Str Biol. 34, 116-122 (2015).
  8. Lewis, J. S., van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines. Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).
  9. Abbondanzieri, E. A., Greenleaf, W. J., Shaevitz, J. W., Landick, R., Block, S. M. Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase. Nature. 438 (7067), 460-465 (2005).
  10. Yeeles, J. T. P., Deegan, T. D., Janska, A., Early, A., Diffley, J. F. X. Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins. Nature. 519 (7544), 431-435 (2015).
  11. Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation. Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).
  12. Remus, D., et al. Concerted loading of Mcm2-7 double hexamers around DNA during DNA replication origin licensing. Cell. 139 (4), 719-730 (2009).
  13. Frigola, J., Remus, D., Mehanna, A., Diffley, J. F. X. ATPase-dependent quality control of DNA replication origin licensing. Nature. 495 (7441), 339-343 (2013).
  14. Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E. P., Diffley, J. F. X. Origin licensing requires ATP binding and hydrolysis by the MCM replicative helicase. Mol Cell. 55 (5), 666-677 (2014).
  15. Coster, G., Diffley, J. F. X. Bidirectional eukaryotic DNA replication is established by quasi-symmetrical helicase loading. Science. 357 (6348), 314-318 (2017).
  16. Miller, T. C. R., Locke, J., Greiwe, J. F., Diffley, J. F. X., Costa, A. Mechanism of head-to-head MCM double-hexamer formation revealed by cryo-EM. Nature. 575 (7784), 704-710 (2019).
  17. Abid Ali, F., et al. Cryo-EM structure of a licensed DNA replication origin. Nat Commun. 8 (1), 1-10 (2017).
  18. Sánchez, H., et al. DNA replication origins retain mobile licensing proteins. Nat Commun. 12 (1), 1908 (2021).
  19. Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins. Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).
  20. Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).
  21. Langston, L. D., et al. CMG helicase and DNA polymerase ε form a functional 15-subunit holoenzyme for eukaryotic leading-strand DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43), 15390-15395 (2014).
  22. Sheu, Y. J., Stillman, B. Cdc7-Dbf4 phosphorylates MCM proteins via a docking site-mediated mechanism to promote S phase progression. Mol Cell. 24 (1), 101-113 (2006).
  23. Sheu, Y. J., Stillman, B. The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4. Nature. 463 (7277), 113-117 (2010).
  24. Randell, J. C. W., et al. Mec1 is one of multiple kinases that prime the Mcm2-7 helicase for phosphorylation by Cdc7. Mol Cell. 40 (3), 353-363 (2010).
  25. Greiwe, J. F., et al. Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase. Nat Str Mol Biol. 29 (1), 10-20 (2021).
  26. de Jesús-Kim, L., Friedman, L. J., Ramsoomair, C., Gelles, J., Bell, S. P. DDK regulates replication initiation by controlling the multiplicity of Cdc45-GINS binding to Mcm2-7. eLife. 10, e65471 (2021).
  27. Lewis, J. S., et al. Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly. Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).
  28. Ramírez Montero, D., et al. Nucleotide binding halts diffusion of the eukaryotic replicative helicase during activation. Nat Commun. 14 (1), 2082 (2023).
  29. Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model. Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).
  30. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).
  31. Lewis, J. S., et al. Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication. Mol Cell. 77, 1-9 (2020).
  32. Schauer, G. D., et al. Replisome bypass of a protein-based R-loop block by Pif1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (48), 30354-30361 (2020).
  33. Wasserman, M. R., Schauer, G. D., O’Donnell, M. E., Liu, S. Replication fork activation is enabled by a single-stranded DNA gate in CMG helicase. Cell. 178 (3), 600-611.e16 (2019).
  34. Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase. Nat Commun. 11 (1), 1-15 (2020).
  35. White, D. S., Smith, M. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Strategies for overcoming the single-molecule concentration barrier. ACS Meas Sci Au. 3 (4), 239-257 (2023).
  36. Liachko, I., et al. A comprehensive genome-wide map of autonomously replicating sequences in a naive genome. PLoS Genet. 6 (5), 22 (2010).
  37. Kapadia, N., et al. Processive activity of replicative DNA polymerases in the replisome of live eukaryotic cells. Mol Cell. 80 (1), 114-126.e8 (2020).
  38. Claussin, C., Vazquez, J., Whitehouse, I. Single-molecule mapping of replisome progression. Mol Cell. 82 (7), 1372-1382.e4 (2022).
  39. Polo Rivera, C., Deegan, T. D. Replicon-seq: seeing is believing. Trends Genet. 38 (10), 987-988 (2022).
  40. Sparks, J. L., et al. The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair. Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).
  41. Vrtis, K. B., et al. Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly. Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).
  42. Low, E., Chistol, G., Zaher, M. S., Kochenova, O. V., Walter, J. C. The DNA replication fork suppresses CMG unloading from chromatin before termination. Genes Dev. 34 (21), 1534-1545 (2020).
  43. Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. eLife. 8, 1-35 (2019).
  44. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  45. Candelli, A., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Phys Chem Chem Phys. 13 (16), 7263-7272 (2011).
  46. Candelli, A., et al. Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15090-15095 (2014).
  47. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, S. Entropic elasticity of lambda-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  48. Liu, Z., et al. A biophysics toolbox for reliable data acquisition and processing in integrated force-confocal fluorescence microscopy. ACS Photonics. 11 (4), 1592-1603 (2024).

Tags

Hybrid EnsembleSingle-molecule AssayCMG HelicaseReplisome DynamicsGenome ReplicationTemporal ResolutionSpatial ResolutionFluorescent LabelingS. Cerevisiae PolypeptidesDNA-processing Mechanisms
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ramírez Montero, D., Sánchez, H., van Veen, E., van Laar, T., Solano, B., Diffley, J. F. X., Dekker, N. H. Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG. J. Vis. Exp. (209), e67076, doi:10.3791/67076 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image