完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

1. 二重官能基化直鎖状DNA基質の合成と磁気ビーズへの結合 デスチオビオチンおよびジゴキシゲニン部分を有するDNA基質の二重官能基化20 μg の 23.6 kb プラスミド pGL50-ARS1 (天然の ARS1 複製起点を含み、社内でクローニングされ、ご要望に応じて入手可能) を 200 μg の制限酵素 AflII で 37 °C で 16 時間、最終容量 200 μL の 1x バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、10 mM 酢酸マグネシウム) を直鎖化します。 100 μg/ml BSA、pH 7.9)。注:このステップは、より便利な場合は、歩留まりを低下させることなく4時間に短縮できます。 反応液を65°Cで20分間インキュベートすることにより、AflIIを不活性化します。得られた 4-ヌクレオチド TTAA は、200 μL の直鎖化反応に 60 ユニットの Klenow Fragment (3′ to 5′ exo-) ポリメラーゼ、17 μL の 10x バッファー (500 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT、pH 7.9)、33 μM D-デスチオビオチン-7-dATP、33 μM ジゴキシゲニン-11-dUTP、33 μM dCTP、33 μM dGTP、100 μL を添加して、オーバーハングを平滑化します。 超純水の最終容量370 μMまで、反応液を37°Cで30分間インキュベートします。注:このステップでは、Klenow Fragmentは、各末端に2つのD-デスチオビオチン-7-dATPヌクレオチドと2つのジゴキシゲニン-11-dUTPヌクレオチドを組み込むことにより、直鎖状DNAの両端のオーバーハングを鈍化します。 反応液に10 mM EDTAを添加し、反応液を75°Cで20分間インキュベートしてKlenow Fragmentを不活性化します。超純水で反応量を400μLにします。 4本のS-400スピンカラムをボルテックスし、少なくとも30秒間ボルテックスして樹脂を再懸濁した後、735 x g で1分間遠心分離して保存バッファーを除去します。カラムを洗浄した1.5 mLチューブに移します。 直ちに、各カラムに100 μLのDNA溶液を加え、735 x gで2分間遠心分離します。DNAはフロースルー中にあり、カラムは廃棄できます。 4本のカラムのフロースルーをプールし、ピペットで容量を測定し、分光光度計でDNA濃度を測定します。これは、ビーズに結合したDNAの量を計算するために使用されます。 二重官能基化直鎖DNAのストレプトアビジン被覆磁気ビーズへの結合Vortex M-280ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを30秒間使用して再懸濁します。 再懸濁したM-280ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ4 mgを清潔な1.5 mLチューブに移します。チューブを磁気ラックに置き、ビーズが収集されるまで1分間待ってから、保存バッファーを取り外します。 1xバッファーA(5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA、および1 M NaCl)1 mLをビーズに加え、5秒間ボルテックスして再懸濁します。ビーズを室温で5分間インキュベートします。注:すべてのバッファーは滅菌ろ過する必要があります。時間を節約するために、事前に2xバッファA、1xバッファB(下記参照)、および1xバッファC(下記参照)を大量に作成してください(推奨)。これらのバッファーは、磁気ビーズのメーカーが推奨するもので、-20°Cで保存できます。 チューブをマグネットホルダーに入れ、ビーズが収集されるまで1分間待ってから、バッファーAを取り出します。 ピペッティングによりビーズを400 μLの2倍バッファーAに再懸濁し、次に400 μLの官能基化DNA溶液を加えます(これにより、2倍バッファーAがビーズへのDNA結合に最適な最終濃度1倍に希釈されることに注意してください)。ピペッティングで穏やかに混合します。 ビーズ/DNA混合物を4°Cで一晩インキュベートし、エンドオーバーエンド回転させて、機能化されたDNAがビーズに結合できるようにします。 マグネティックラックを使用して上清を除去し(ピペットでその体積を測定し、分光光度計で未結合DNAの濃度を測定する前に廃棄しないでください)、ビーズを500μLのバッファーB(10 mM HEPES-KOH pH 7.6、1 mM EDTA、および1 M KOAc)で2回洗浄して、非特異的に結合したDNAを除去します。メーカーが推奨する保存バッファーであるバッファーC(10 mM HEPES-KOH pH 7.6および1 mM EDTA)500 μLでビーズを2回洗浄します。ビーズに添加されたDNAの総量と上清に残ったDNAの量を比較することにより、磁気ビーズに結合したDNAの総量を計算します。収率は、磁気ビーズ1mgあたり2.3-2.9mgのDNA(~150-190fmol)の範囲である必要があります。収量が低い場合は、S400カラムが乾燥していないことを確認してから使用してください。ゲル電気泳動によりDNAの完全性を常に監視し、初期のプラスミドDNA基質が分解されていないことを確認します。 ビーズを300 μLのバッファーCに再懸濁し、4°Cで保存します。 ニッキングを防ぐために、1 mgの磁気ビーズの使い捨てアリコートを4つ作成し、DNAを2週間以上保存しないでください。 2. アンサンブルと1分子のハイブリッドアッセイにより、相関デュアルビーム光ピンセットと共焦点顕微鏡法を用いて、完全に再構成されたCMGの動きを画像化し、定量化します。 磁気ビーズ結合DNA(図1C).注:CMGの組み立てと活性化反応は、Mcm2-7のローディングとリン酸化、およびCMGの組み立てと活性化の2段階で行われました。特に指定がない限り、すべてのバッファー交換ステップは、ビーズを磁石で1分間収集し、その後上清を除去することにより、磁気ラックの助けを借りて行われました。すべてのインキュベーションは、蛍光タンパク質の光退色を防ぐために、蓋付きの温度制御されたヒートブロックで行われました。蓋が利用できない場合は、チューブを錫箔で覆う必要があります。このプロトコルで使用されるすべてのタンパク質の精製および蛍光標識は、前述のように実施されています10,11,28.Mcm2-7のローディングとリン酸化DNA結合ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ1mgを取り、保存バッファー(バッファーC)を取り出します。 ビーズを200 μLのローディングバッファー(25 mM HEPES-KOH pH 7.6、100 mM Kグルタミン酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40代替品、10%グリセロール、2 mM DTT、100 μg/mL BSA、および5 mM ATP)で洗浄します。 ローディングバッファーを取り外し、ビーズを75 μLのローディングバッファーに再懸濁します。ピペッティングで穏やかに混合します。 ビーズ結合DNAに最終濃度37.5 nMのORCを添加し、800 rpmの攪拌を行いながら30°Cで5分間反応をインキュベートします。 Cdc6を最終濃度50 nMで添加し、800 rpmの攪拌を行いながら30°Cで5分間反応をインキュベートします。 最終濃度100 nMでMcm2-7/Cdt1(または蛍光標識されたMcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1)を添加し、800 rpmの攪拌で30°Cで20分間反応をインキュベートします。 最終濃度100 nMでDDKを添加し、800 rpmの攪拌を行いながら30°Cで反応を30分間インキュベートします。 上清を取り除き、ビーズ結合DNA(リン酸化Mcm2-7ヘキサマーを含む)を200 μLの高塩洗浄(HSW)バッファー(25 mM HEPES-KOH pH 7.6、300 mM KCl、10 mM MgOAc、0.02% NP40代替物、10%グリセロール、1 mM DTT、および400 μg/mL BSA)で洗浄します。ピペッティングで混合し、ビーズがバッファー内に完全に再懸濁され、凝集物が見えないことを確認します。 HSWバッファーを取り外し、ビーズを200 μLのCMGバッファー(25 mM HEPES-KOH pH 7.6、250 mM Kグルタミン酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40代替品、10%グリセロール、1 mM DTT、および400 μg/mL BSA)で1回洗浄します。 蛍光標識CMGの組み立てと活性化CMGバッファーを取り出し、DNA結合ビーズを5 mM ATPを添加した50 μLのCMGバッファーに再懸濁します。 ビーズ結合DNAに50 nM Dpb11、200 nM GINS、30 nM Polɛ、20 nM S-CDK、50 nM Cdc45LD555、30 nM Sld3/7、55 nM Sld2、および10 nM Mcm10を添加します。このステップでは、DNAにタンパク質を添加する直前に、すべてのタンパク質を1つのチューブで混合し、氷の上に置きます。再懸濁したビーズ結合DNAをタンパク質ミックスに加えます。反応を30°Cで15分間インキュベートし、800rpmの撹拌を行います。 ビーズを200μLのHSWバッファーで3回洗浄します。ビーズを200 μLのCMGバッファーで1回洗浄します。 磁気ビーズからのインタクトDNA:CMG複合体の溶出(図1D)CMGバッファーを磁気ビーズから取り出し、CMG含有DNA結合磁気ビーズを200 μLの溶出バッファー(10 mMビオチンを添加したCMGバッファー)に再懸濁して、磁気ビーズからDNA:CMG複合体を溶出します。800 rpmの撹拌を行いながら、室温で1時間インキュベートします。 チューブを磁気ラックに入れ、ビーズを5分間収集します。上清(溶出されたDNA:CMG複合体を含む)を沈殿したビーズを乱さずに慎重に収集し、新しいチューブに移します。 溶液中にビーズが残らないようにするため(溶液中に残った磁気ビーズはアッセイの光トラップ部分に干渉する可能性があるため)、回収した上清を再び磁気ラックに置き、残ったビーズをさらに5分間回収します。上清を慎重に収集し、新しいチューブに移します。 200 μLの上清に1400 μLのCMGバッファーを加えます。これで、サンプルを1分子イメージングする準備が整いました。 相関デュアルビーム光ピンセットと共焦点顕微鏡法(図1E-G).注:アッセイの単一分子部分は、デュアルビーム光ピンセットと共焦点顕微鏡およびマイクロ流体工学を組み合わせた商用セットアップで実施されます45,46 (図1E-G)ですが、自作のセットアップで実施することもできます。ここで使用される商用セットアップには、5つの入口(それぞれチャネル1〜5と呼ばれる)と1つの出口(図1E).以下の手順では、すべてのボタンやパネルの名前は、この商用セットアップで提供されるソフトウェアに固有のものです。市販のセットアップの5つのインレットを次のように使用します:左からチャネル1〜3を注入し、ビーズトラップ(チャネル1)、DNA-タンパク質複合体の結合(チャネル2)、およびCMGの存在の確認(チャネル3)に使用します。チャネル4および5は、タンパク質リザーバーおよびバッファー交換位置として使用します。各実験の前に、1 mg/mL のウシ血清アルブミンでマイクロ流体フローセルを少なくとも 30 分間不動態化し、続いて 0.5% プルロニック F-127 を超純水に溶解します。各実験の各チャネルの内容が説明どおりであることを確認します (図 1E)。チャンネル1:抗ジゴキシゲニン被覆ポリスチレンビーズ(直径2.06μm)をPBSで1:50に希釈。チャンネル2:DNA:磁気ビーズから溶出するCMG複合体。チャンネル3:イメージングバッファー(CMGバッファーに2 mM 1,3,5,7シクロオクタテトラエン、2 mM 4-ニトロベンジルアルホホール、および2 mM Troloxを添加);チャンネル4および5:25 nM RPA、10 nM Mcm10、および5 mM ATP、5 mM ATPγS、またはヌクレオチドなしのいずれかを添加したイメージングバッファー。 実験の前に、ソフトウェアのパワーコントロールパネルにあるRe-calibrateボタンをクリックして、両方のトラップ33,46で0.3 pN / nmの剛性を達成するためにトラッピングレーザー出力を調整します。ソフトウェアのImage Scanパネルで、共焦点ピクセルサイズを50 x 50 nm、画像サイズを160 x 18ピクセル、ピクセルあたりの照明時間を0.2 ms、フレームレートを5秒に設定します。[温度]パネルで温度制御を30°Cに設定します。注:さらに、最大ステージ速度(チャネル間の移動に使用)を0.2 mm/sに設定して、抗力によるDNAからのCMGの解離を最小限に抑えることをお勧めします。 注入ポートで0.5 barの一定圧力ですべての溶液をフローセルに流します(これはソフトウェアの圧力バーパネルで設定できます)。次に、チャネル 4 と 5 のフローをオフにします。最初にすべての溶液を流した後、圧力を0.2バールに下げます。 トラップレーザーをチャネル1に移動し、各光トラップに1つのビーズが引っかかるまで移動させます。トリガーを押しながらジョイスティックを動かして、トラップされたビーズをチャンネル2に移動します。次いで、DNAテザーが捕捉されるまで、引き金を押さずにジョイスティックを使用して右のビーズを左のビーズに近づけたり遠ざけたりすることにより、DNA:CMG複合体を釣る(これは、ソフトウェアのFDビューアパネルでトラップされたDNA47 の力-伸長曲線を監視することによって知られている)。DNAテザリングの場合は、DNAの長さと正しい温度値をReference Modelパネルに入力すると、FD ViewerパネルにDNAコンストラクトの理論的な拡張可能なワーム様鎖モデルが自動的にプロットされます。1つのDNA分子が2つのビーズの間に挟まれている場合、DNAの力-伸長挙動は、プロットされた拡張可能なワーム様鎖モデルと密接に一致するはずです。これが当てはまることを確認するには、実験的な力-伸長曲線を監視し、ソフトウェアが理論上の曲線の上に自動的にプロットします。注:理論モデルからの逸脱は、ビーズ間に結合した複数のDNA分子の存在、および/またはDNAに結合して圧縮するタンパク質凝集体の存在を示している可能性があります。力によるタンパク質のDNAからの解離を防ぐために、この初期試験では10pNの張力を超えないようにしてください。 ビーズをチャネル3に移動し、すべてのチャネルで流れをすぐに停止します。チャンネル3で1フレームのテストスキャンを行い、CMGの存在を確認し、対物レンズで測定した4μWのパワーで561nmレーザーで照らします。Excitation lasersパネルでイメージングレーザーの出力を調整します。存在する場合、CMG は 、図 1G と 図 2A に示すように、2 次元回折限界スポットとして表示されます。DNAを捕捉できない場合は、チャネル2に気泡がないか確認し、チャネル2の流れを遅くする可能性があります(チャネル1および3と比較して)。気泡が存在する場合は、チャネル2の圧力を1バールに上げて、気泡を洗い流してみてください。 CMGが存在する場合は、DNAテザーをチャネル4または5に移動してイメージングします。それ以外の場合は、フローを再びオンにし、ビーズを破棄して、ステップ 2.2.4 に戻ります。 チャネル4または5で、ビーズ間の距離を調整して、DNAテザーの初期張力を2pNにします。このためには、Force Spectroscopyパネルに2 pNを入力し、Enableボタンをクリックしてフォースクランプを開始します。初期張力が2 pNに達したら、イメージング前にフォーススペクトロスコープパネルの[Enable]ボタンをクリックして、フォースクランプを無効にします。 対物レンズで測定した4μWの出力で561nmレーザーを使用して、CMGCdc45-LD555 を5秒ごとに画像化します(図1F)。これを行うには、イメージスキャンパネルの[スキャンの開始]ボタンをクリックします。このようなスキャンでは、CMGは 図1Gの例のように、2次元の回折限界スポットとして表示されます。CMGが観察されたが、漂白前に動かないように見える場合は、DNA上の傷がCMGをDNA41から解離させ、その見かけの処理能力を大幅に低下させるため、ヌクレアーゼ活性に使用されるすべてのタンパク質をテストしてください。注:ここで使用する市販の顕微鏡を使用する場合、4μWのレーザー出力で一貫した結果が得られるはずです。自作のセットアップを使用する場合は、最適なレーザー出力を経験的に見積もることをお勧めします。最適なレーザー出力は、蛍光色素分子から目的の精度で局在化するのに十分な信号を提供し、蛍光色素分子の寿命が実験の目的の時間範囲に近いものでなければなりません。注:この出版物は、ハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイに焦点を当てているが、我々は以前に、このアッセイ48で生成されたデータの分析の包括的な説明を発表している。