Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Todos los procedimientos de manejo e inyección de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del NINDS. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales del NINDS. 1. Preparación previa a la inyección Preparación de la dosis de AAVDetermine el peso promedio de los ratones que serán inyectados. Calcule el volumen máximo permitido de inyectar de acuerdo con las pautas de cuidado animal de la institución, como se muestra en la ecuación (1). El volumen máximo de inyección suele ser un valor de volumen (μL)/peso del ratón (g) (por ejemplo, 10 μL/g.).Volumen máximo de inyección (μL)/ratón= (volumen máximo de inyección (μL/g)) × (peso medio del ratón (g)) (1)NOTA: Cálculo de la muestra: Volumen máximo de inyectado/ratón= 10 μL/g × 20 g/ratón= 200 μL/ratón Establezca la dosis del genoma vectorial (vg) de AAV que se administrará por ratón.NOTA: Este podría ser el mismo valor absoluto en diferentes ratones (por ejemplo, todos los ratones reciben 1,5 × 1012 vg, independientemente de cuánto pese cada ratón). O bien, la dosis puede estar en vg/kg, por lo que el total de vg que se inyectará por ratón debe calcularse para cada ratón de acuerdo con el peso de ese ratón el día de la inyección.Si la dosis es en vg/kg, pesar cada ratón el día de la inyección antes de la preparación de la dosis. Calcule los genomas vectoriales que se entregarán para cada ratón de acuerdo con su peso utilizando la ecuación (2):Genomas vectoriales que se entregarán en un ratón específico (vg) = Valor preespecificado de vg/kg (vg/kg) × (2)NOTA: El uso de vg/kg como unidad de dosis en lugar de vg/ratón podría ser más apropiado en ciertos estudios preclínicos para garantizar comparaciones válidas entre las dosis inyectadas. Esto se debe a las diferencias de peso entre ratones machos y hembras de la misma edad o posiblemente entre ratones del mismo sexo. Utilícese el volumen máximo de inyección y la dosis de AAV (vg) para calcular los volúmenes de AAV en stock y solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) que se necesitan para preparar la dosis requerida (véanse las ecuaciones (3-6)). Asegúrese de que el volumen a inyectar sea igual o inferior al volumen máximo de inyección permitido. Prepare siempre un volumen de inyección que sea al menos 15 μL mayor que el volumen que se inyectará para tener en cuenta los errores de pipeteo y el espacio muerto de la jeringa.Concentración de inyectado (vg/μL) = (3)Total de genomas de vectores AAV que deben añadirse para preparar el inyectado (vg) = Concentración de inyectado (vg/μL) × volumen que debe prepararse (μL) (4)Volumen de caldo de AAV que debe añadirse para preparar el inyectado) (μL) = (5)Volumen de PBS que debe añadirse para preparar el inyectado (μL) = Volumen que debe prepararse (μL) – Volumen de material de AAV que debe añadirse para preparar el inyectado (μL) (6)NOTA: Ejemplo de cálculo:6 × 1013 vg/kg (la dosis) se administrará en 200 μL/ratón (el volumen a inyectar) en un ratón que pese 25 g. El título de stock de AAV es de 3,0 × 1013 (vg/mL)Genomas vectoriales que se entregarán en este ratón específico (vg) = 6 × 1013 (vg/kg) × = 1,5 × 1012 vg para este ratónConcentración de inyectado= = 7,5 × 109 (vg/μL)Total de genomas de vectores AAV que deben añadirse para preparar la inyección = 7,5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1,6125 ×10 12 (vg)Volumen de stock de AAV que debe añadirse para preparar el inyectado = = 53,75 (μL)Volumen de PBS que debe añadirse para preparar el inyectado = 215 (μL) – 53,75 (μL) = 161,25 (μL) Procedimiento de preparación de la dosis de AAVNOTA: Siguiendo las pautas de bioseguridad y EPP de la institución para el manejo de AAV, en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL sin RNasa y sin DNasa esterilizado en autoclave, prepare la inyección de AAV utilizando el stock de AAV y PBS estéril de acuerdo con los cálculos del paso 1.1.3.3. Mantenga siempre el AAV de stock y el AAV inyectado en hielo. Utilice micropipetas limpias y nuevas cajas de puntas de micropipeta para garantizar la esterilidad. Deseche las puntas de micropipeta contaminadas con AAV de acuerdo con las pautas de gestión de residuos de la institución.Descongele el AAV original con hielo.NOTA: Evite descongelar y volver a congelar el stock de AAV. Pida o prepare el stock de AAV en alícuotas de 100-200 μL para evitar tener un exceso de AAV después de la preparación de la dosis que tendrá que volver a congelarse. Preparación de la estación de inyecciónLimpiezaLimpie el área de trabajo con etanol (EtOH) al 70%. Desinfecte el área de trabajo con reactivos bactericidas, fungicidas y virucidas. Limpie el sujetador del tubo del ratón con agua y jabón. Configuración de las herramientas de la estaciónColoque un tubo cónico limpio y vacío de 15 ml en un soporte/rejilla para tubos. Coloque una plataforma elevada en la que se colocará el sujetador del tubo del ratón (Figura 1A, B). Coloque el sujetador de tubo de ratón limpio en el área de trabajo. Si inyecta ratones que son mucho más pequeños que el tubo de retención de ratón disponible, use un cono de plástico para roedores para hacer una funda de restricción. Consulte los pasos 2.1.3-4. Coloque las jeringas que se utilizarán para las inyecciones en el área de trabajo. Utilice jeringas de insulina de 0,3 ml con agujas de 29 g. Coloque el contenedor de residuos lo más cerca posible de la estación de inyección para permitir la eliminación inmediata de las herramientas contaminadas con AAV. Tire y empuje el émbolo de cada jeringa varias veces para asegurarse de que el émbolo se mueva suavemente para que no haya resistencia causada por la jeringa durante la inyección. Si el émbolo no se mueve suavemente, deseche esta jeringa y reemplácela por una nueva. Tenga una báscula de ratón y una mini centrífuga disponibles junto al área de inyección. Tenga listo el AAV preparado en hielo en el área de inyección. Prepare agua tibia (38-40 °C). Tenga cuidado de que la temperatura del agua no supere los 40 °C para evitar causar quemaduras en la cola del ratón. 2. Procedimiento de inyección Restricción del ratónPesar cada ratón para calcular la dosis en vg/kg si es necesario. Asegúrese de que el mouse esté completamente sujeto y no pueda moverse.NOTA: Si el ratón no está completamente sujeto, podría moverse durante la administración intravenosa, lo que provocaría el desplazamiento de la aguja. Esto puede hacer que la aguja se salga de la vena y/o lesione al ratón. Para el retenedor de tubo:Lave el protector con agua tibia y jabón entre ratones para limpiar y calentar el soporte. Sostén el ratón por la cola. Inserta la cola del ratón en la abertura superior del tubo; Luego, tire lentamente del mouse en el sujetador de tubos. Si el tamaño del sujetador de tubo es adecuado para el tamaño del ratón, coloque el tapón delante del ratón para evitar que el ratón se escape.NOTA: El enchufe debe estar lo suficientemente cerca del mouse para evitar que el mouse se mueva o gire dentro del tubo, pero el enchufe no debe obstruir la nariz del mouse para permitir que el mouse respire libremente. Si el ratón es más pequeño que el tamaño del sistema de retención del tubo, utilice un cono de restricción desechable flexible además del sistema de retención del tubo, como se describe a continuación en el paso 2.1.4. Para los conos de sujeción desechables flexibles si es necesario (para hacer una funda de sujeción para ratones más pequeños):Haz un corte en el extremo de la nariz del cono para asegurarte de que la nariz del ratón no esté obstruida y que tenga suficiente espacio para respirar. Corte la parte posterior del cono de modo que el cono tenga casi la misma longitud que el ratón (para que el cono quepa dentro del tubo) (Figura 1A, B). Coloque el ratón en el sujetador de tubos como se describe anteriormente en los pasos 2.1.3. Mientras sostiene la cola del ratón, inserte primero el cono de restricción con el lado de apertura más ancho en el tubo. Mientras sostienes la cola del ratón, deja que el ratón camine hacia el cono; Luego, desliza el resto del cono dentro del tubo. Asegúrate de que la cola del ratón esté completamente fuera de la parte posterior del tubo y que el ratón tenga espacio para respirar dentro del cono. Asegure el tapón del tubo inmediatamente frente a la abertura de la nariz del cono mientras se asegura de que el mouse esté completamente sujeto y tenga suficiente espacio para respirar. Inyectar el ratónLlene el tubo cónico de 15 ml con agua tibia. Coloque el sujetador de tubo con el ratón dentro de él en la plataforma elevada (Figura 1B). Sumerja tanto como sea posible de la cola del ratón sujeta en el agua tibia durante al menos 1 minuto hasta que las venas laterales estén claramente dilatadas y visibles (Figura 1B). Durante el paso de calentamiento de la cola, cargue la dosis de AAV en la jeringa.Coloque el tubo de microcentrífuga de 1,7 mL sin tapar que contiene AAV en una rejilla para tubos. Inserte la aguja verticalmente en el tubo con la mano dominante. Una vez que la aguja esté dentro del tubo, sostenga el tubo con la mano no dominante.NOTA: La inserción vertical de la aguja evita daños a la aguja que podrían ser causados por el contacto con la pared del tubo. Se pueden utilizar otros métodos alternativos de carga de jeringas, pero se debe garantizar la seguridad del experimentador y del ratón inyectado. Sujetar el tubo con la mano no dominante protege contra lesiones accidentales por punción de la aguja si la aguja se inserta mientras se sostiene el tubo. Con la aguja dentro del tubo, levante el tubo y la jeringa simultáneamente a la altura de los ojos mientras se asegura de que la aguja no toque la pared del tubo. Apoya ambos brazos sobre la mesa para estabilizarlos. Introduzca lentamente la dosis en la jeringa.NOTA: La aspiración lenta evita que las burbujas de aire finas se adhieran a los lados del cilindro de la jeringa. Expulse las burbujas de aire de la jeringa. Si inyecta AAV, asegúrese de que las burbujas de aire sean expulsadas de la jeringa sobre una almohadilla absorbente desechable que se desechará en una caja de riesgo biológico. Mantenga la inyección durante al menos 40 segundos para calentarla.NOTA: Asegúrese siempre de que la inyección esté tibia antes de la inyección. Si se administra una inyección fría, es posible que la inyección no fluya a través de la vena, excepto los primeros μL. Revisa las venas de la cola cada minuto.NOTA: Las venas deben ser MUY visibles hasta el sitio de la inyección (agregue tiempo de calentamiento de la cola y reemplácelo con agua tibia fresca según sea necesario hasta que la vena sea claramente visible, pero sin exceder el tiempo de restricción del ratón permitido por el protocolo de manejo de animales de la institución). Después de asegurarse de que las venas sean claramente visibles, retire el sujetador de tubo de la parte superior de la plataforma elevada y colóquelo directamente sobre la mesa. Coloque el ratón en el sujetador con los pies hacia abajo y no hacia los lados para facilitar el manejo de la cola.NOTA: El mouse no debe estar de lado o hacia atrás dentro del restricción. El ratón debe estar completamente sujeto, y no puede moverse o girar dentro del sujetador ni mover/tirar de su cola. Limpie rápidamente la cola con una gasa para secar la cola; Limpie la cola con un hisopo con alcohol y luego séquela con una gasa seca.NOTA: Use una gasa seca para que la cola esté lo suficientemente seca como para permitir un agarre seguro de la cola, pero no completamente seca. Puede ser más difícil ver la vena cuando la cola está completamente seca. Gira la cola aproximadamente 90° hacia la izquierda o hacia la derecha para que una de las dos venas laterales quede hacia arriba. Ubique un sitio de inyección adecuado dentro del tercio medio de la cola. Inicie la inyección inicial distalmente (más cerca de la punta de la cola) y muévase proximalmente si se requieren inyecciones adicionales debido a intentos fallidos o si el diseño experimental lo requiere.NOTA: No intente inyectar distal a un sitio de inyección anterior, ya que la inyección podría filtrarse fuera de ese sitio de inyección anterior. Opcional: utilice el pulgar y el índice de la mano no dominante para aplicar presión proximal (aguas arriba/más cerca del cuerpo del ratón) en el lugar de la inyección durante 10 s. Los dedos actúan como torniquetes para dilatar aún más la vena en el lugar de la inyección. Inmediatamente después del torniquete de 10 s, suelte los dedos del torniquete y asegúrese de que una de las dos venas laterales esté hacia arriba y sea claramente visible. Sujete la cola con la mano no dominante utilizando el pulgar y el índice inmediatamente distales al lugar de la inyección. Doble la cola sobre el dedo índice para que el sitio de la inyección quede plano sobre el dedo índice. Tire hacia atrás de la cola para que la cola quede estirada y el sitio de inyección esté completamente horizontal (a 0°) (paralelo a la mesa horizontal) (Figura 1C). Sostenga la jeringa con los dedos índice y medio de la mano dominante a cada lado del reborde del cilindro de la jeringa mientras mantiene el pulgar listo en el émbolo.NOTA: Esto hará que sea más fácil no mover el pulgar o la aguja una vez que la aguja esté dentro de la vena (Figura 1C). Apoye ambas manos sobre la mesa para estabilizarlas y coloque la aguja directamente sobre y paralela a la cola y la vena con el bisel hacia arriba. Mantenga el sitio de inyección cerca del dedo índice que sostiene la cola para mejorar el control y la estabilidad del sitio de inyección.NOTA: El sujetador del tubo debe estar lo suficientemente profundo en la mesa para que ambas manos estén apoyadas en la mesa. Mientras mantiene la aguja paralela a la vena de la cola y aplica presión hacia abajo sobre la aguja, deslice la aguja hacia adelante en la vena.NOTA: La presión hacia abajo debe ser suficiente para insertar la aguja en el ángulo correcto en la vena. La vena es extremadamente poco profunda, por lo que la aguja debe ser lo más plana posible cuando se intente entrar en la vena. Inyecte lentamente la solución en la vena. Después de administrar la dosis, retire lentamente la aguja e inmediatamente aplique presión con una gasa en el lugar de la inyección durante al menos 10 segundos para detener el sangrado.NOTA: Aplique la presión todo el tiempo que sea necesario hasta que el sangrado se haya detenido por completo para evitar la posible pérdida del reactivo inyectado. Por lo general, aparece una gota de sangre después de retirar la aguja, lo que indica que la aguja ha penetrado en la vena. En ocasiones, la gota de sangre no aparece incluso con una inyección exitosa. La gota de sangre no indica que la inyección sea exitosa; solo indica que la aguja penetró en la vena. El indicador fiable de éxito de la inyección es la ausencia total de resistencia del émbolo durante la inyección. Si la aguja está dentro de la vena, no debe haber resistencia en el émbolo de la aguja durante la inyección del inyecto, y la vena proximal al sitio de inyección aparecerá momentáneamente de un color ligeramente más claro (blanqueamiento) (el blanqueamiento de la vena puede no ser muy claro en algunas cepas de ratón). Si hay resistencia y/o comienza a aparecer una protuberancia en el lugar de la inyección, entonces la aguja no está colocada correctamente dentro de la vena. Si esto ocurre, retire completamente la aguja de la cola e intente inyectar la vena en un nuevo sitio de inyección proximal al sitio de inyección fallido (más cerca del cuerpo del ratón). Deseche las jeringas y tubos contaminados con AAV de acuerdo con las pautas de manejo de desechos de la institución. Libere al ratón de los grilletes y colóquelo de nuevo en una nueva jaula separada de los ratones no inyectados. Monitoree los ratones durante 10 minutos para garantizar niveles normales de actividad después de la inyección.NOTA: Esto evita la posible transmisión de agentes inyectables a ratones no inyectados si se administran agentes transmisibles. Desinfecte el área de trabajo con reactivos bactericidas, fungicidas y virucidas y EtOH al 70%. Limpie el sujetador del tubo del ratón con agua y jabón. 3. Disección y recolección y fijación de tejidos27 Preparación de la estación de recolección de tejidosLimpie la estación de trabajo con un reactivo de degradación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante para degradar el ADN contaminante que pueda estar presente en el área de trabajo. Coloque el metilbutano en un recipiente de metal. Coloque el recipiente de metal de metilbutano dentro de una caja de espuma de poliestireno; Luego, rodee el recipiente de metal con hielo seco para que el nivel de hielo seco que rodea el recipiente sea más alto que el nivel de metilbutano dentro del recipiente. Etiquete y coloque los tubos vacíos de almacenamiento de tejido de microcentrífuga de 2 ml sobre el hielo seco. Deje que los tubos de almacenamiento de metilbutano y tejidos se enfríen en hielo seco durante al menos 20 minutos antes de comenzar a congelar los tejidos. Coloque pinzas de transferencia de tejido sobre hielo seco. Etiquete y llene otro juego de tubos de almacenamiento de tejidos de microcentrífuga de 2 ml con paraformaldehído (PFA) fresco al 4% y manténgalos a temperatura ambiente. Agregue suficiente PFA al 4% a cada tubo para sumergir completamente los tejidos que se colocarán en el tubo. Recolección y fijación de tejidosEutanasiar al ratón de acuerdo con las pautas de cuidado animal de la institución.NOTA: Aquí, los ratones fueron sacrificados utilizando la dislocación cervical. Rocíe completamente el mouse con 70% de EtOH. Recoja los pañuelos necesarios.NOTA: El protocolo de recolección y fijación descrito aquí se probó en los músculos esqueléticos y el hígado. En el caso de los tejidos que se utilizarán para la extracción de ADN:Deje caer el tejido en metilbutano preenfriado sobre hielo seco y deje el tejido en metilbutano durante al menos 1 minuto. Utilice las pinzas de transferencia preenfriadas para transferir los tejidos congelados del metilbutano a los tubos de almacenamiento de tejidos de microcentrífuga vacíos de 2 ml preenfriados. Almacene el pañuelo a -80 °C.NOTA: Opcional: El tejido se puede cortar en trozos de 20 mg antes de sumergirlo en metilbutano para que esté listo para ser utilizado en el paso 4.1.4. En el caso de los tejidos que se utilizarán para el análisis histológico y para preservar la fluorescencia de las proteínas reporteras:Usando una pinza designada para PFA que se mantiene a temperatura ambiente, coloque los tejidos en su respectivo tubo de microcentrífuga que contiene un 4% de PFA (mantenido a temperatura ambiente) mientras se asegura de que el tejido esté completamente sumergido en la solución de PFA al 4%.NOTA: La contaminación por PFA puede afectar negativamente a diferentes ensayos moleculares posteriores. Solo use pinzas designadas para PFA cuando manipule PFA para evitar la contaminación de PFA de otros tejidos o herramientas. Coloque los tubos de la microcentrífuga en una rejilla y cúbrala con papel de aluminio para mantener los tubos en la oscuridad. Incubar la rejilla cubierta a 4 °C en una coctelera agitando suavemente durante la noche. Después de la incubación durante la noche, prepare sacarosa al 5% (% p/v) en 1x PBS disolviendo 5,0 g. de sacarosa en 70 mL de 1x PBS agitando vigorosamente. Agregue suficiente 1x PBS a un volumen total final de 100 mL para lograr una solución de sacarosa al 5% (% p/v). Esterilice la solución de sacarosa al 5% con el filtro de jeringa de 0,22 μm. Etiquete y llene los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml con sacarosa al 5% recién preparada. Transfiera los tejidos de PFA al 4% a su respectivo tubo de microcentrífuga que contiene un 5% de sacarosa (mantenido a temperatura ambiente) mientras se asegura de que el tejido esté completamente sumergido en la solución de sacarosa al 5%. Coloque los tubos de la microcentrífuga en una rejilla y cúbrala con papel de aluminio para mantener los tubos en la oscuridad. Incubar la rejilla cubierta a 4 °C en una coctelera agitando suavemente durante la noche. Después de la incubación durante la noche, prepare sacarosa al 20% (% p/v) en 1x PBS disolviendo 20,0 g. de sacarosa en 70 mL de 1x PBS agitando vigorosamente. Agregue suficiente 1x PBS a un volumen total final de 100 mL para lograr una solución de sacarosa al 20% (% p/v). Esterilice la solución de sacarosa al 20% con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Etiquete y llene los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml con sacarosa al 20% recién preparada. Transfiera los tejidos de sacarosa al 5% a su respectivo tubo de microcentrífuga que contiene un 20% de sacarosa (mantenida a temperatura ambiente) mientras se asegura de que el tejido esté completamente sumergido en la solución de sacarosa al 20%. Coloque los tubos de la microcentrífuga en una rejilla y cúbrala con papel de aluminio para mantener los tubos en la oscuridad. Incubar la rejilla cubierta a 4 °C en una coctelera agitando suavemente durante la noche. Después de la incubación durante la noche, coloque el metilbutano en un recipiente de metal y coloque el recipiente de metal de metilbutano dentro de una caja de espuma de poliestireno. Rodee el recipiente de metal con hielo seco para que el nivel de hielo seco que rodea el recipiente sea más alto que el nivel de metilbutano dentro del recipiente. Etiquete y coloque los tubos vacíos de almacenamiento de tejido de microcentrífuga de 2 ml sobre hielo seco. Deje que los tubos de almacenamiento de metilbutano y tejidos se enfríen en hielo seco durante al menos 20 minutos antes de comenzar a congelar los tejidos. Coloque pinzas de transferencia sobre hielo seco. Seque rápidamente los pañuelos con toallitas de precisión para eliminar el exceso de sacarosa al 20%. Deje caer el tejido en metilbutano preenfriado sobre hielo seco. Deje el tejido en metilbutano durante al menos 1 minuto. Utilice las pinzas de transferencia preenfriadas para transferir los tejidos congelados del metilbutano a los tubos de almacenamiento de tejidos de microcentrífuga vacíos de 2 ml preenfriados. Almacene el pañuelo a -80 °C. 4. dPCR para la cuantificación de vg/dg Extracción de ADN de los tejidos y digestión inicial del ARNNOTA: El manual del kit de extracción de ADN que figura en la Tabla de Materiales se utilizó para derivar este protocolo de extracción de ADN. Mantenga siempre los tubos que contienen los trozos de tejido congelados sobre hielo seco.Prepara un cubo de hielo. Para cada muestra de ADN, etiquete un tubo de perlas de lisis de 1,5 mL y dos tubos de microcentrífuga vacíos sin RNasa y sin DNasa de 1,7 mL. Añada 180 μL del primer tampón del kit de extracción de ADN a cada tubo de perlas. Tara el primer tubo de perlas que contiene tampón.NOTA: Si los pañuelos no fueron precortados en el paso 3.2.4.1, use una cuchilla de afeitar previamente enfriada en hielo seco para cortar el pañuelo en trozos de 20 mg. Este paso debe realizarse dentro de un criostato limpio mantenido a -20 °C o más frío. Agregue un pedazo de pañuelo en el tubo; Pesar y registrar el peso del tejido (que sea ~20 mg.). Coloque inmediatamente el tubo de perlas de lisis con el tejido en él sobre hielo. El búfer podría cristalizarse. Repita los pasos anteriores para cada muestra de tejido. Transfiera los tubos a la mezcladora de tubos de bolas de lisis y hágalos funcionar durante 1 min a velocidad máxima (velocidad 10) a 4 °C. Coloque las muestras en hielo para transferirlas a la centrífuga. Centrifugar durante 1 min a 20.000 × g a 4 °C. Durante la etapa de centrifugación, agregue 20 μL de proteinasa K a la primera serie de tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Después de la etapa de centrifugación, transfiera el sobrenadante de los homogeneizados a los tubos de 1,7 mL que contienen la proteinasa K y mezcle bien. Incubar a 56 °C durante 15 min, con una mezcla de 500 RPM. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Añadir 4 μL de RNasa A y mezclar mediante un breve vórtice de pulsos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Vórtice de pulso durante 15 s. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Añadir 200 μL del segundo tampón del kit de extracción de ADN. Vórtice de pulso durante 15 s. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Añadir 200 μL de EtOH al 100%. Vórtice de pulso durante 15 s. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Transfiera los lisados a la columna de centrifugación de extracción de ADN. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recolección. Añada 500 μL del tercer tampón del kit de extracción de ADN a la columna de centrifugación. Girar a 6.000 × g durante 1 min. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recolección. Añada 500 μL del cuarto tampón del kit de extracción de ADN a la columna de centrifugación. Centrifugar a 20.000 × g durante 3 min. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Agregue 100 μL de agua de grado molecular a la columna de centrifugación. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Mida la concentración de ADN si es necesario. Almacenar a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o a -20 °C para almacenamiento a largo plazo. Extracción de ADN de células clasificadas por FACSNOTA: El manual del kit de extracción de ADN que figura en la Tabla de Materiales se utilizó para derivar este protocolo de extracción de ADN.Después de clasificar las células, centrifugue las muestras a 300 × g durante 5 s para recoger todas las gotas de los lados y la tapa. Asegúrese de recoger todas las gotas.NOTA: Si el volumen de la muestra es inferior a 1,5 ml, continúe directamente con el siguiente paso. Si el volumen de la muestra es superior a 1,5 mL, retire con cuidado y deseche la parte superior del sobrenadante con una micropipeta, dejando 1-1,5 mL de la muestra. Mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Centrifugar a 515 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante a excepción de los últimos 50 μL. Vuelva a suspender el pellet en 50 μL del primer tampón del kit de extracción de ADN para un volumen final de 100 μL. Siga el protocolo del fabricante para el aislamiento de ADN genómico a partir de pequeños volúmenes de sangre (ver Tabla de Materiales).Añadir 10 μL de proteinasa K y 100 μL de segundo tampón del kit de extracción de ADN; Mezclar por pulso-vórtice durante 15 s. Incubar las muestras a 56 °C durante 10 min mezclando a 300 RPM. Mezcle las muestras dos veces mediante una inversión suave durante este período de incubación. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Añadir 50 μL de EtOH al 100% y mezclar por pulso-vórtice durante 15 s. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min. Recoja las gotas de las paredes y la tapa del tubo centrifugando el tubo durante 1-2 s con una mini centrífuga. Transfiera las muestras a la columna de extracción de ADN (la columna está en un tubo de recolección de 2 mL) sin mojar el borde. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Después de colocar la columna en un tubo de recolección limpio de 2 mL, deseche el tubo de recolección que contiene el flujo. Añadir 500 μL del tercer tampón del kit de extracción de ADN a la columna sin mojar el borde y centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Nuevamente, después de colocar la columna en un tubo de recolección limpio de 2 mL, deseche el tubo de recolección que contiene el flujo. Añadir 500 μL del cuarto tampón del kit de extracción de ADN a la columna sin mojar el borde y centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Coloque la columna en un tubo colector limpio de 2 ml y deseche el tubo colector que contiene el flujo. Centrifugar a 20.000 × g durante 3 min. Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,7 ml y deseche el tubo de recolección que contiene el flujo. Agregue 20 μL de agua de grado molecular al centro de la membrana de la columna para la elución; Cierre la tapa e incube las muestras con agua de grado molecular a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 20.000 × g durante 1 min. Almacene el ADN eluido a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o a -20 °C para almacenamiento a largo plazo. Digestión y limpieza de ARNNOTA: El manual del kit de extracción de ADN que figura en la Tabla de Materiales se utilizó para derivar este protocolo de limpieza de ADN. Dependiendo de las condiciones de dPCR, los reactivos y los diseños de cebadores y sondas, puede ser necesario garantizar la ausencia completa de ARN en la muestra de ADN antes de proceder a la cuantificación de dPCR vg/dg. La contaminación por ARN puede dar lugar a varios grados de valores vg/dg inexactos en determinadas condiciones de dPCR.En un tubo de PCR de 0,2 ml o en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, añada como máximo 20 μl de la muestra de ADN extraída y 1,5 μl de la RNasa libre de DNasa a cada muestra de ADN. Si el volumen de la mezcla de ADN/ARNasa es inferior a 21,5 μL, añada suficiente agua de grado molecular hasta un volumen final de 21,5 μL y mezcle 25 veces invirtiendo los tubos. Incubar a 37 °C durante 30 min con mezclas periódicas cada 10 min invirtiendo los tubos.NOTA: La cantidad total de ácidos nucleicos añadidos al tubo debe estar entre 175 ng y 700 ng. Es posible que sea necesario realizar modificaciones si las muestras de ADN contienen volúmenes o cantidades de ácidos nucleicos fuera de este rango o si las muestras de ADN se aislaron de manera diferente. Coloque sobre hielo durante 2 min. Agregue suficiente agua de grado molecular a cada mezcla de ADN/RNasa hasta un volumen final de 100 μL.NOTA: Se recomienda la RNasa enumerada aquí, ya que digiere el ARN contaminante sin afectar negativamente al ADN objetivo ni a los ensayos de PCR posteriores. Siga el protocolo del fabricante para la limpieza del ADN genómico (consulte la tabla de materiales).Agregue 10 μL del primer tampón del kit de extracción de ADN y 250 μL del segundo tampón del kit de extracción de ADN. Mezclar por pulso-vórtice durante 10 s. Transfiera las muestras a la columna de extracción de ADN en un tubo de recolección de 2 ml sin mojar el borde. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Después de colocar la columna en un tubo de recolección limpio de 2 mL, deseche el tubo de recolección que contiene el flujo. Añada 500 μL del segundo tampón del kit de extracción de ADN a la columna sin mojar el borde. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Coloque la columna en un tubo colector limpio de 2 ml y deseche el tubo colector que contiene el flujo. Centrifugar a 20.000 × g durante 6 min. Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,7 ml y deseche el tubo de recolección que contiene el flujo. Agregue 20 μL de agua de grado molecular al centro de la membrana de la columna para la elución, cierre la tapa e incube las muestras con agua de grado molecular a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 20.000 × g durante 1 min. Almacenar a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o a -20 °C para almacenamiento a largo plazo. Confirme la ausencia de contaminación por ARN en la muestra digerida por ARNasa con PCR o dPCR de punto final o PCR cuantitativa (qPCR) utilizando un par de cebadores de PCR que amplificarían una región de ARNm que abarca múltiples exones y no solo un exón.NOTA: El objetivo de ARNm debe ser de un gen altamente expresado en el tejido/tipo de célula objetivo para garantizar que la contaminación por ARNm se identifique correctamente si está presente. Los amplicones que abarcan múltiples exones diferencian entre las bandas resultantes de la contaminación del ARNm y el ADN genómico. Tenga siempre una muestra de ADN digerida sin ARNasa como control positivo para la reacción de PCR para asegurarse de que se detectará la contaminación por ARNm si está presente. PCR digital (dPCR)PCR de punto final para comprobar la especificidad de los cebadores y las condiciones óptimas de PCR (opcional)Diseñar pares de cebadores y sondas de dPCR para el genoma del vector y pares de cebadores de dPCR y sondas para el gen de referencia del ratón que se utilizarán para cuantificar los genomas diploides de la muestra.NOTA: Apunte a un tamaño de amplicón entre 60 pb y 150 pb. El gen de referencia del ratón debe ser un gen que tenga un número constante de copias genéticas por genoma diploide. Para los cálculos enumerados aquí, el gen de referencia (Polr2a) tiene dos copias por genoma diploide. Para una reacción de PCR de punto final de 10 μL, prepare la mezcla de PCR utilizando los reactivos y las concentraciones finales que se utilizarán posteriormente para la reacción de dPCR. Agregue la muestra de ADN molde digerido por RNasa (rango de cantidad de ácidos nucleicos 56-223 ng) a una concentración final de 1x mezcla maestra de dPCR que contenga la ADN polimerasa y dNTP, 0,8 μM de cada cebador directo, 0,8 μM de cada cebador inverso, 0,4 μM de cada sonda y 0,025 U/μL de enzima de restricción (la concentración final de la enzima de restricción depende de la enzima de restricción y la marca utilizada). Agregue agua de grado molecular para alcanzar un volumen final de 10 μL.NOTA: Debe haber al menos dos pares de cebadores y dos sondas en la mezcla de PCR: un par de cebadores y una sonda para detectar el genoma del vector y un par de cebadores y una sonda para detectar el genoma del ratón. Condiciones de ciclo térmico de PCR: Paso inicial de activación del calor a 95 °C durante 2 min, seguido de 35-45 ciclos de un paso de desnaturalización a 95 °C durante 25 s y un paso combinado de recocido/extensión a 58-62 °C durante 1 min.NOTA: Se debe determinar la temperatura óptima de recocido para cada par de amplicones y cebadores. El número de ciclos se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de ADN molde en la muestra. Visualice el producto de PCR en un gel de agarosa utilizando electroforesis en gel para determinar la presencia de las bandas de amplicón objetivo y cualquier posible banda de amplificación no específica. Continúe con el siguiente paso de dPCR después de confirmar que los pares de cebadores y las condiciones de ciclo dan como resultado una amplificación específica de las secuencias objetivo. Reacción de dPCRPara una reacción de dPCR de 40 μL, agregue hasta 4 μL de la muestra de ADN molde digerida por RNasa (rango de cantidad de ácidos nucleicos de 50 a 330 ng) a una concentración final de 1x mezcla maestra de dPCR que contenga la ADN polimerasa y dNTP, 0,8 μM de cada cebador directo, 0,8 μM de cada cebador inverso, 0,4 μM de cada sonda, y 0,025 U/μL de enzima de restricción (la concentración final de la enzima de restricción depende de la enzima de restricción y de la marca utilizada). Agregue agua de grado molecular para alcanzar un volumen final de 40 μL. Condiciones de ciclo térmico de dPCR: Paso inicial de activación por calor a 95 °C durante 2 min, seguido de 40-50 ciclos de un paso de desnaturalización a 95 °C durante 25 s, y un paso combinado de recocido/extensión a 58-62 °C durante 1 min.NOTA: Se debe determinar la temperatura óptima de recocido para cada par de amplicones y cebadores. El número de ciclos se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de ADN molde en la muestra. Los volúmenes, concentraciones y condiciones enumerados aquí están optimizados para las placas, los reactivos y el dispositivo de dPCR enumerados en la Tabla de materiales. Estas condiciones reducen el efecto de cualquier inhibidor potencial de dPCR que pueda reducir la precisión de la reacción. Después de ejecutar la reacción de dPCR y obtener los valores absolutos de los genomas del vector y del gen de referencia del ratón, calcule vg/dg en la muestra utilizando las ecuaciones (7-8).Para genes de referencia con dos copias de genes/genoma diploide:Valor absoluto de los genomas diploides (dg) = (7)vg/dg = (8) Compruebe el diagrama de dispersión 1D de la reacción de dPCR para confirmar la validez del ensayo y la cuantificación (Figura 3A,C). Para que el ensayo sea válido, confirme que el diagrama de dispersión 1D cumple todos los criterios siguientes: la presencia de particiones positivas y negativas; separación clara entre las particiones positiva y negativa para permitir una determinación precisa del umbral; y la presencia de gotas nulas o pocas entre las particiones positiva y negativa (también conocida como lluvia), lo que puede reducir la precisión de la cuantificación de la dPCR.