Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Alle procedures voor het hanteren en injecteren van dieren werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van NINDS. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de NINDS-richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik. 1. Voorbereiding vóór de injectie Voorbereiding van de AAV-dosisBepaal het gemiddelde gewicht van de muizen die geïnjecteerd zullen worden. Bereken het maximaal toegestane injecteervolume volgens de richtlijnen voor dierverzorging van de instelling, zoals weergegeven in vergelijking (1). Het maximale injectaatvolume is doorgaans een volumewaarde (μL)/muisgewicht (g) (bijv. 10 μL/g.).Maximaal injectaatvolume (μL)/muis= (maximaal injectaatvolume (μL/g)) × (gemiddeld muisgewicht (g)) (1)OPMERKING: Voorbeeldberekening: Maximaal injecteervolume/muis = 10 μL/g × 20 g/muis = 200 μL/muis Stel de dosis AAV-vectorgenoom (vg) in die per muis moet worden toegediend.OPMERKING: Dit kan dezelfde absolute waarde zijn voor verschillende muizen (bijv. alle muizen ontvangen 1,5 × 1012 vg, ongeacht hoeveel elke muis weegt). Of de dosis kan in vg/kg zijn, dus het totale vg dat per muis moet worden geïnjecteerd, moet voor elke muis worden berekend op basis van het gewicht van die muis op de injectiedag.Als de dosis in vg/kg is, weeg dan elke muis op de injectiedag voorafgaand aan de dosisbereiding. Bereken de vectorgenomen die voor elke muis moeten worden geleverd op basis van zijn gewicht met behulp van vergelijking (2):Vectorgenomen die in een specifieke muis moeten worden afgeleverd (vg) = Vooraf gespecificeerde vg/kg-waarde (vg/kg) × (2)OPMERKING: Het gebruik van vg/kg als dosiseenheid in plaats van vg/muis kan in bepaalde preklinische onderzoeken geschikter zijn om geldige vergelijkingen tussen geïnjecteerde doses te garanderen. Dit komt door de gewichtsverschillen tussen mannelijke en vrouwelijke muizen van dezelfde leeftijd of mogelijk tussen muizen van hetzelfde geslacht. Gebruik het maximale injectaatvolume en de AAV-dosis (vg) om de hoeveelheden AAV-voorraad en steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te berekenen die nodig zijn om de vereiste dosis te bereiden (zie vergelijkingen (3-6)). Zorg ervoor dat het te injecteren volume gelijk is aan of kleiner is dan het toegestane maximale injecteervolume. Bereid altijd een injecteervolume voor dat ten minste 15 μl groter is dan het volume dat zal worden geïnjecteerd om rekening te houden met pipetteerfouten en de dode ruimte van de spuit.Concentratie van injectaat (vg/μL) = (3)Totaal aantal AAV-vectorgenomen dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (vg) = Concentratie van het injectaat (vg/μL) × te bereiden volume (μL) (4)Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden) (μL) = (5)Volume PBS dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (μL) = Volume dat moet worden bereid (μL) – Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden (μL) (6)OPMERKING: Voorbeeld berekening:6 × 1013 vg/kg (de dosis) wordt toegediend in 200 μL/muis (het te injecteren volume) in een muis die 25 g weegt. De AAV-voorraadtiter is 3,0 × 1013 (vg/ml)Vectorgenomen die in deze specifieke muis moeten worden afgeleverd (vg) = 6 × 1013 (vg/kg) × = 1,5 × 1012 vg voor deze muisConcentratie van injectaat = = 7,5 × 109 (vg/μL)Totaal AAV-vectorgenomen die moeten worden toegevoegd om het injectaat voor te bereiden = 7,5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1,6125 × 1012 (vg)Volume AAV-voorraad dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden = = 53,75 (μL)Volume PBS dat moet worden toegevoegd om het injectaat te bereiden = 215 (μL) – 53,75 (μL) = 161,25 (μL) Procedure voor de voorbereiding van de AAV-dosisOPMERKING: Volgens de bioveiligheids- en PBM-richtlijnen van de instelling voor het omgaan met AAV, bereidt u in een geautoclaveerde steriele RNasevrije en DNasevrije microcentrifugebuis van 1,7 ml het AAV-injectaat voor met behulp van de AAV-voorraad en steriele PBS volgens de berekeningen in stap 1.1.3.3. Bewaar altijd de voorraad AAV en AAV injecteren op ijs. Gebruik schone micropipetten en nieuwe micropipettipdoosjes om de steriliteit te garanderen. Gooi de met AAV besmette micropipetpunten weg volgens de richtlijnen voor afvalbeheer van de instelling.Ontdooi de voorraad AAV op ijs.OPMERKING: Vermijd het ontdooien en opnieuw invriezen van de AAV-voorraad. Bestel of bereid de AAV-voorraad in aliquots van 100-200 μL om te voorkomen dat er na de dosisbereiding een teveel aan AAV ontstaat dat opnieuw moet worden ingevroren. Voorbereiding van het injectiestationReinigingReinig het werkgebied met 70% ethanol (EtOH). Desinfecteer het werkgebied met een bacteriedodend, schimmeldodend en virusdodend reagens(en). Reinig de muisslanghouder met water en zeep. Installatie van stationstoolsPlaats een schone, lege conische slang van 15 ml in een slanghouder/rek. Zet een verhoogd platform op waarop de muisbuishouder wordt geplaatst (Figuur 1A,B). Plaats de schone muisslangbeschermer in het werkgebied. Als u muizen injecteert die veel kleiner zijn dan de beschikbare muisbuisbeschermer, gebruik dan een plastic knaagdierbeschermerkegel om een fixatiehuls te maken. Zie stappen 2.1.3-4. Plaats de spuiten die voor injecties zullen worden gebruikt in het werkgebied. Gebruik insulinespuiten van 0,3 ml met naalden van 29 G. Plaats de afvalcontainer zo dicht mogelijk bij het injectiestation om met AAV besmette gereedschappen onmiddellijk te kunnen afvoeren. Trek en duw meerdere keren aan de zuiger van elke spuit om ervoor te zorgen dat de zuiger soepel beweegt, zodat er tijdens de injectie geen weerstand wordt veroorzaakt door de spuit. Als de zuiger niet soepel beweegt, gooi deze spuit dan weg en vervang deze door een nieuwe. Zorg dat er een muisweegschaal en minicentrifuge beschikbaar zijn naast het injectiegebied. Houd de voorbereide AAV op ijs klaar in het injectiegebied. Bereid warm water (38-40 °C). Zorg ervoor dat de watertemperatuur niet hoger is dan 40 °C om brandwonden aan de muizenstaart te voorkomen. 2. Procedure voor injectie Muis in bedwang houdenWeeg elke muis om de dosis in vg/kg te berekenen, indien nodig. Zorg ervoor dat de muis volledig in bedwang wordt gehouden en niet kan bewegen.OPMERKING: Als de muis niet volledig wordt vastgehouden, kan deze bewegen tijdens de IV-toediening, wat kan leiden tot verplaatsing van de naald. Hierdoor kan de naald uit de ader komen en/of de muis verwonden. Voor buisvergrendeling:Was de restrainer met warm water en zeep tussen de muizen om de houder schoon te maken en op te warmen. Houd de muis bij zijn staart vast. Steek de staart van de muis in de bovenste opening van de buis; Trek vervolgens de muis langzaam in de slangvergrendeling. Als de maat van de buisbeschermer geschikt is voor de grootte van de muis, plaatst u de plug voor de muis om te voorkomen dat de muis ontsnapt.NOTITIE: De plug moet dicht genoeg bij de muis zijn om te voorkomen dat de muis beweegt of draait in de buis, maar de plug mag de neus van de muis niet belemmeren zodat de muis vrij kan ademen. Als de muis kleiner is dan de maat van de slangbeschermer, gebruik dan naast de slangbeugel ook een flexibele wegwerpbeugelconus, zoals hieronder beschreven in stap 2.1.4. Voor de flexibele wegwerp restrainer cones indien nodig (om een fixatiehuls te maken voor kleinere muizen):Maak een snee aan het neusuiteinde van de kegel om ervoor te zorgen dat de neus van de muis niet wordt belemmerd en dat de muis voldoende ruimte heeft om te ademen. Knip de achterkant van de kegel zo af dat de kegel bijna even lang is als de muis (zodat de kegel in de buis past) (Figuur 1A,B). Plaats de muis in de buishouder zoals hierboven beschreven in stap 2.1.3. Terwijl u de staart van de muis vasthoudt, steekt u de conus van de restrainer met de bredere openingszijde eerst in de buis. Terwijl je de staart van de muis vasthoudt, laat je de muis in de kegel lopen; Schuif vervolgens de rest van de kegel in de buis. Zorg ervoor dat de staart van de muis helemaal uit de achterkant van de buis komt en dat de muis ruimte heeft om in de kegel te ademen. Zet de slangplug direct voor de neusopening van de kegel vast en zorg ervoor dat de muis volledig op zijn plaats wordt gehouden en voldoende ruimte heeft om te ademen. De muis injecterenVul de conische slang van 15 ml met warm water. Plaats de buisrestrainer met de muis erin op het verhoogde platform (Figuur 1B). Dompel zoveel mogelijk van de staart van de in bedwang gehouden muis minimaal 1 minuut in het warme water totdat de zijaders duidelijk verwijd en zichtbaar zijn (Figuur 1B). Laad tijdens de stap van het opwarmen van de staart de AAV-dosis in de spuit.Plaats de niet-afgedekte AAV-bevattende microcentrifugebuis van 1.7 ml in een buisrek. Steek de naald verticaal in de buis met de dominante hand. Zodra de naald in de buis zit, houdt u de buis vast met de niet-dominante hand.NOTITIE: Het verticaal inbrengen van de naald voorkomt schade aan de naald die kan worden veroorzaakt door het aanraken van de buiswand. Er kunnen andere alternatieve methoden voor het laden van injectiespuiten worden gebruikt, maar de veiligheid van de onderzoeker en de geïnjecteerde muis moet worden gegarandeerd. Het vasthouden van de slang met de niet-dominante hand beschermt tegen verwondingen door het per ongeluk prikken van de naald als de naald wordt ingebracht terwijl u de slang vasthoudt. Met de naald in de tube tilt u de tube en de spuit tegelijkertijd op tot ooghoogte en zorgt u ervoor dat de naald de wand van de tube niet raakt. Laat beide armen op de tafel rusten om ze te stabiliseren. Trek de dosis langzaam in de spuit.OPMERKING: Langzame aspiratie voorkomt dat fijne luchtbellen zich hechten aan de zijkanten van de spuitcilinder. Verdrijf luchtbellen uit de spuit. Als u AAV injecteert, zorg er dan voor dat de luchtbellen uit de spuit worden verdreven via een absorberend wegwerpverband dat wordt weggegooid in een doos met biologisch gevaar. Houd het injectaat minstens 40 s vast om het op te warmen.OPMERKING: Zorg er altijd voor dat het injectaat warm is voordat u gaat injecteren. Als een koude injectie wordt toegediend, kan het zijn dat de injectie niet door de ader stroomt, behalve de eerste paar μL. Controleer de staartaders elke minuut.OPMERKING: De aderen moeten ZEER zichtbaar zijn tot aan de injectieplaats (voeg de opwarmtijd van de staart toe en vervang indien nodig door vers warm water totdat de ader duidelijk zichtbaar is, maar niet langer dan de fixatietijd van de muis die is toegestaan door het protocol voor het omgaan met dieren van de instelling). Nadat u ervoor heeft gezorgd dat de aders duidelijk zichtbaar zijn, verwijdert u de buisbeugel van de bovenkant van het verhoogde platform en plaatst u de buisbeugel direct op de tafel. Plaats de muis in de restrainer met de voeten naar beneden en niet opzij om de staart gemakkelijk te kunnen hanteren.NOTITIE: De muis mag niet op zijn zij of rug in de restrainer liggen. De muis moet volledig in bedwang worden gehouden en niet in staat zijn om in de beugel te bewegen of te draaien of zijn staart te bewegen/trekken. Veeg de staart snel af met een gaasje om de staart te drogen; Veeg de staart af met een alcoholdoekje en veeg hem vervolgens droog met een droog gaasje.OPMERKING: Gebruik droog gaas om de staart droog genoeg te maken om de staart stevig vast te pakken, maar niet helemaal droog. Het kan moeilijker zijn om de ader te zien als de staart helemaal droog is. Draai de staart ongeveer 90° naar links of rechts zodat een van de twee zijaders naar boven wijst. Zoek een geschikte injectieplaats in het middelste derde deel van de staart. Start de eerste injectie distaal (dichter bij het puntje van de staart) en beweeg proximaal als er extra injecties nodig zijn vanwege mislukte pogingen of als het experimentele ontwerp dit vereist.OPMERKING: Probeer niet distaal van een eerdere injectieplaats te injecteren, aangezien het injectiemiddel uit die vorige injectieplaats kan lekken. Optioneel: gebruik de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand om gedurende 10 s proximaal (stroomopwaarts/dichter bij het muislichaam) druk uit te oefenen op de injectieplaats. De vingers fungeren als tourniquets om de ader op de injectieplaats verder te verwijden. Laat onmiddellijk na de tourniquet van 10 s de vingers van de tourniquet los en zorg ervoor dat een van de twee zijaders naar boven wijst en duidelijk zichtbaar is. Houd de staart vast met de niet-dominante hand met behulp van de duim en wijsvinger direct distaal van de injectieplaats. Vouw de staart over de wijsvinger zodat de injectieplaats plat op de wijsvinger ligt. Trek de staart naar achteren zodat de staart gestrekt is en de injectieplaats volledig horizontaal is (op 0°) (evenwijdig aan de horizontale tafel) (Figuur 1C). Houd de spuit vast met de wijs- en middelvinger van de dominante hand aan weerszijden van de flens van de cilinder van de spuit terwijl u de duim bij de zuiger gereed houdt.NOTITIE: Dit maakt het gemakkelijker om de duim of de naald niet te bewegen als de naald eenmaal in de ader zit (Figuur 1C). Laat beide handen op de tafel rusten om ze te stabiliseren en plaats de naald direct op en evenwijdig aan de staart en de ader met de afschuining naar boven gericht. Houd de injectieplaats dicht bij de wijsvinger en houd de staart vast om de controle en stabiliteit van de injectieplaats te verbeteren.NOTITIE: De buisvergrendeling moet diep genoeg in de tafel zitten, zodat beide handen op de tafel worden ondersteund. Terwijl u de naald evenwijdig aan de staartader houdt en neerwaartse druk uitoefent op de naald, schuift u de naald naar voren in de ader.NOTITIE: De neerwaartse druk moet voldoende zijn om de naald in de juiste hoek in de ader te steken. De ader is extreem ondiep, dus de naald moet zo plat mogelijk zijn als u in de ader probeert te komen. Injecteer de oplossing langzaam in de ader. Trek na toediening van de dosis de naald langzaam terug en oefen onmiddellijk druk uit met een gaasje op de injectieplaats gedurende ten minste 10 s om het bloeden te stoppen.OPMERKING: Oefen de druk zo lang als nodig uit totdat het bloeden volledig is gestopt om mogelijk verlies van het geïnjecteerde reagens te voorkomen. Na het terugtrekken van de naald verschijnt er meestal een bloeddruppel, wat aangeeft dat de naald de ader is binnengedrongen. Af en toe verschijnt de bloeddruppel niet, zelfs niet bij een succesvolle injectie. De bloeddruppel geeft geen succesvolle injectie aan; Het geeft alleen aan dat de naald de ader is binnengedrongen. De betrouwbare indicator voor succesvolle injectie is de volledige afwezigheid van plunjerweerstand tijdens de injectie. Als de naald zich in de ader bevindt, mag er tijdens de injectie van het injectaat geen weerstand zijn bij de zuiger van de naald en zal de ader proximaal van de injectieplaats tijdelijk iets lichter van kleur lijken (blanches) (het blancheren van de ader is mogelijk niet erg duidelijk bij sommige muizenstammen). Als er weerstand is en/of er begint een uitstulping te verschijnen op de injectieplaats, dan is de naald niet correct in de ader geplaatst. Als dit gebeurt, verwijder dan de naald volledig van de staart en probeer de ader te injecteren op een nieuwe injectieplaats proximaal van de mislukte injectieplaats (dichter bij het lichaam van de muis). Gooi de met AAV besmette spuiten en slangen weg volgens de richtlijnen voor afvalbeheer van de instelling. Bevrijd de muis van de restrainers en plaats hem terug in een nieuwe kooi, gescheiden van niet-geïnjecteerde muizen. Houd de muizen gedurende 10 minuten in de gaten om een normaal activiteitsniveau na de injectie te garanderen.OPMERKING: Dit voorkomt mogelijke overdracht van geïnjecteerde middelen naar niet-geïnjecteerde muizen als overdraagbare middelen worden toegediend. Desinfecteer het werkgebied met bacteriedodende, schimmeldodende en virusdodende reagens(en) en 70% EtOH. Reinig de muisslanghouder met water en zeep. 3. Dissectie en weefselafname en fixatie27 Voorbereiding van het weefselafnamestationReinig het werkstation met een DNA-afbraakreagens volgens de instructies van de fabrikant om besmettend DNA dat in het werkgebied aanwezig kan zijn, af te breken. Doe methylbutaan in een metalen bakje. Plaats de methylbutaan metalen container in een piepschuimdoos; Omring vervolgens de metalen container met droogijs, zodat het niveau van het droogijs rond de container hoger is dan het methylbutaangehalte in de container. Etiketteer en plaats lege 2 ml microcentrifuge-tissuebewaarbuisjes op het droogijs. Laat de methylbutaan- en weefselopslagbuisjes minstens 20 minuten afkoelen op droogijs voordat u begint met het invriezen van de weefsels. Plaats een weefseltransfertang op droogijs. Label en vul nog een set van 2 ml microcentrifuge-weefselbewaarbuisjes met verse 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar ze op kamertemperatuur. Voeg voldoende 4% PFA toe aan elke buis om de weefsels die in de buis worden geplaatst volledig onder te dompelen. Weefselverzameling en fixatieEuthanaseer de muis volgens de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling.OPMERKING: Hier werden de muizen geëuthanaseerd met behulp van cervicale dislocatie. Spuit de muis volledig in met 70% EtOH. Verzamel de benodigde tissues.OPMERKING: Het hier beschreven verzamel- en fixatieprotocol is getest op skeletspieren en de lever. Voor weefsels die zullen worden gebruikt voor DNA-extractie:Laat het weefsel in voorgekoeld methylbutaan op droogijs vallen en laat het weefsel minstens 1 minuut in methylbutaan vallen. Gebruik de voorgekoelde transfertang om de bevroren weefsels van het methylbutaan over te brengen naar de voorgekoelde lege microcentrifuge-weefselopslagbuisjes van 2 ml. Bewaar het weefsel bij -80 °C.OPMERKING: Optioneel: Het weefsel kan in stukjes van 20 mg worden gesneden voordat het in methylbutaan wordt gedruppeld, zodat het klaar is voor gebruik in stap 4.1.4. Voor weefsels die zullen worden gebruikt voor histologische analyse en voor het behoud van de fluorescentie van reportereiwitten:Gebruik een PFA-specifieke pincet die op kamertemperatuur wordt gehouden, laat de weefsels in hun respectievelijke microcentrifugebuis vallen die 4% PFA bevat (op kamertemperatuur bewaard) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 4% PFA-oplossing.OPMERKING: PFA-verontreiniging kan een negatieve invloed hebben op verschillende stroomafwaartse moleculaire tests. Gebruik alleen een door PFA aangewezen pincet bij het hanteren van PFA om PFA-besmetting van andere weefsels of gereedschappen te voorkomen. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes. Bereid na een nacht incubatie 5% sacharose (% g/v) in 1x PBS door 5,0 g. sucrose op te lossen in 70 ml 1x PBS door krachtig te schudden. Voeg voldoende 1x PBS toe aan een uiteindelijk totaal volume van 100 ml om een sucrose-oplossing van 5% (% m/v) te verkrijgen. Steriliseer de 5% sucrose-oplossing met behulp van het spuitfilter van 0,22 μm. Etiketteer en vul 2,0 ml microcentrifugebuisjes met vers bereide 5% sucrose. Breng de weefsels van 4% PFA over naar hun respectievelijke microcentrifugebuis die 5% sucrose bevat (op kamertemperatuur bewaard) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 5% sucrose-oplossing. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes. Bereid na een nacht incubatie 20% sacharose (% m/v) in 1x PBS door 20,0 g. sucrose op te lossen in 70 ml 1x PBS door krachtig te schudden. Voeg voldoende 1x PBS toe aan een uiteindelijk totaal volume van 100 ml om een 20% sucrose-oplossing (% w/v) te verkrijgen. Steriliseer de 20% sucrose-oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Etiketteer en vul 2,0 ml microcentrifugebuisjes met vers bereide 20% sucrose. Breng de weefsels van 5% sucrose over naar hun respectievelijke microcentrifugebuis die 20% sucrose bevat (bewaard bij kamertemperatuur) terwijl u ervoor zorgt dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de 20% sucrose-oplossing. Plaats de microcentrifugebuisjes op een rekje en bedek het rekje met foliepapier om de buisjes in het donker te houden. Incubeer het afgedekte rek bij 4 °C op een shaker en schud het een nacht zachtjes. Plaats na een nacht incubatie methylbutaan in een metalen container en plaats de methylbutaan metalen container in een piepschuimdoos. Omring de metalen container met droogijs zodat het niveau van het droogijs rond de container hoger is dan het methylbutaangehalte in de container. Etiketteer en plaats lege 2 ml microcentrifuge-tissuebewaarbuisjes op droogijs. Laat de methylbutaan- en weefselopslagbuisjes minstens 20 minuten afkoelen op droogijs voordat u begint met het invriezen van de weefsels. Plaats een transfertang op droogijs. Dep de weefsels snel met precisiedoekjes om overtollige 20% sucrose te verwijderen. Laat het weefsel in methylbutaan voorgekoeld op droogijs vallen. Laat het weefsel minstens 1 minuut in methylbutaan liggen. Gebruik de voorgekoelde transfertang om de bevroren weefsels van het methylbutaan over te brengen naar de voorgekoelde lege microcentrifuge-weefselopslagbuisjes van 2 ml. Bewaar het weefsel bij -80 °C. 4. dPCR voor kwantificering van vg/dg DNA-extractie uit weefsels en initiële RNA-verteringOPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-extractieprotocol af te leiden. Bewaar de buisjes met de bevroren tissuestukjes altijd op droogijs.Zet een emmer ijs klaar. Label voor elk DNA-monster één lysiskombuisje van 1,5 ml en twee lege RNasevrije en DNasevrije microcentrifugebuisjes van 1,7 ml. Voeg 180 μL van de buffer van de eerste DNA-extractiekit toe aan elke parelbuis. Tarra de eerste hielbuis met buffer.OPMERKING: Als de tissues niet zijn voorgesneden in stap 3.2.4.1, gebruik dan een scheermesje dat is voorgekoeld op droogijs om het weefsel in stukjes van 20 mg te snijden. Deze stap moet worden uitgevoerd in een schone cryostaat die bij -20 °C of kouder wordt bewaard. Voeg een stuk weefsel toe aan de buis; Weeg en registreer het gewicht van het weefsel (~20 mg.). Plaats het lysis-kralenbuisje met het weefsel erin direct op ijs. De buffer kan kristalliseren. Herhaal de vorige stappen voor elk weefselmonster. Breng de buizen over in de blender van de lysiskralenbuis en laat ze 1 minuut draaien op maximale snelheid (snelheid 10) bij 4 °C. Leg de monsters op ijs om ze over te brengen naar de centrifuge. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 × g bij 4 °C. Voeg tijdens de centrifugatiestap 20 μl proteïnase K toe aan de eerste reeks microcentrifugebuisjes van 1,7 ml. Breng na de centrifugatiestap het supernatans van de homogenaten over in de buisjes van 1,7 ml die de proteïnase K bevatten en meng goed. Incubeer bij 56 °C gedurende 15 minuten, met 500 RPM mengen. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 4 μL RNase A toe en meng door middel van korte pulsvortexen. Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. Pulse-vortex gedurende 15 s. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 200 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe. Pulse-vortex gedurende 15 s. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 200 μL 100% EtOH toe. Pulse-vortex gedurende 15 s. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Breng de lysaten over naar de spinkolom van de DNA-extractie. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 min. Plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis. Voeg 500 μL van de buffer van de derde DNA-extractiekit toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 min. Plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis. Voeg 500 μL van de buffer van de vierde DNA-extractiekit toe aan de spinkolom. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 3 min. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg 100 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan de spinkolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Centrifugeer op 6.000 × g gedurende 1 minuut op kamertemperatuur. Meet indien nodig de DNA-concentratie. Bewaren bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag. DNA-extractie uit FACS-gesorteerde cellenOPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-extractieprotocol af te leiden.Centrifugeer de monsters na het sorteren van de cellen gedurende 5 s bij 300 × g om alle druppels aan de zijkanten en het deksel op te vangen. Zorg ervoor dat alle druppels worden opgevangen.OPMERKING: Als het monstervolume minder is dan 1.5 ml, ga dan direct verder met de volgende stap. Als het monstervolume groter is dan 1,5 ml, verwijder dan voorzichtig het bovenste gedeelte van het supernatans met behulp van een micropipet en gooi het weg, zodat er 1-1,5 ml van het monster overblijft. Meng het monster door meerdere keren op en neer te pipetteren en breng het monster over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Centrifugeer bij 515 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg, behalve de laatste 50 μl. Resuspendeer de pellet in 50 μl van de buffer van de eerste DNA-extractiekit voor een eindvolume van 100 μl. Volg het protocol van de fabrikant voor de isolatie van genoom-DNA uit kleine hoeveelheden bloed (zie Materiaaltabel).Voeg 10 μL proteïnase K en 100 μL tweede DNA-extractiekitbuffer toe; Meng door pulse-vortexing gedurende 15 s. Incubeer de monsters bij 56 °C gedurende 10 minuten met 300 RPM mengen. Meng de monsters tijdens deze incubatieperiode twee keer door middel van zachte inversie. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Voeg 50 μL 100% EtOH toe en meng door pulse-vortexing gedurende 15 s. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de druppels van de wanden en het deksel van de buis door de buis 1-2 s te centrifugeren met behulp van een minicentrifuge. Breng de monsters over naar de DNA-extractiekolom (de kolom bevindt zich in een verzamelbuis van 2 ml) zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut. Nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de verzamelbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de derde DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g . Nogmaals, nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de opvangbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de vierde DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g . Plaats de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de doorstroombevattende opvangbuis weg. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 3 minuten. Plaats de kolom in een schone microcentrifugebuis van 1.7 ml en gooi de doorstroombevattende verzamelbuis weg. Voeg 20 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan het midden van het kolommembraan voor elution; Sluit het deksel en incubeer de monsters met het water van moleculaire kwaliteit bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 1 min. Bewaar het geëlueerde DNA bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag. RNA-vertering en opruimingOPMERKING: Het handboek van de DNA-extractiekit die in de materiaaltabel wordt vermeld, is gebruikt om dit DNA-opruimprotocol af te leiden. Afhankelijk van de dPCR-omstandigheden, reagentia en primer- en sondeontwerpen, kan het nodig zijn om de volledige afwezigheid van RNA in het DNA-monster te garanderen voordat wordt overgegaan tot de kwantificering van dPCR vg/dg. RNA-contaminatie kan onder bepaalde dPCR-omstandigheden leiden tot verschillende gradaties van onnauwkeurige vg/dg-waarden.Voeg in een PCR-buisje van 0,2 ml of een microcentrifugebuisje van 1,7 ml maximaal 20 μl van het geëxtraheerde DNA-monster en 1,5 μl van het DNasevrije RNase toe aan elk DNA-monster. Als het volume van de DNA/RNase-mix minder is dan 21,5 μL, voeg dan voldoende water van moleculaire kwaliteit toe tot een eindvolume van 21,5 μL en meng 25x door de buisjes om te keren. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met periodiek mengen om de 10 minuten door de buizen om te keren.OPMERKING: De totale hoeveelheid nucleïnezuren die aan de buis wordt toegevoegd, moet tussen 175 ng en 700 ng zijn. Aanpassingen kunnen nodig zijn als de DNA-monsters volumes of nucleïnezuurhoeveelheden bevatten die buiten dit bereik liggen of als DNA-monsters anders zijn geïsoleerd. Zet 2 minuten op het ijs. Voeg voldoende moleculair water toe aan elke DNA/RNase-mix tot een eindvolume van 100 μL.OPMERKING: Het hier vermelde RNase wordt aanbevolen omdat het het verontreinigende RNA verteert zonder het doel-DNA of stroomafwaartse PCR-tests negatief te beïnvloeden. Volg het protocol van de fabrikant voor het opschonen van genoom-DNA (zie Materiaaltabel).Voeg 10 μL van de buffer van de eerste DNA-extractiekit en 250 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe. Meng door pulse-vortexing gedurende 10 s. Breng de monsters over naar de DNA-extractiekolom in een verzamelbuisje van 2 ml zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut. Nadat u de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml hebt geplaatst, gooit u de verzamelbuis met de doorstroom weg. Voeg 500 μL van de buffer van de tweede DNA-extractiekit toe aan de kolom zonder de rand nat te maken. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 1 minuut. Plaats de kolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de doorstroombevattende opvangbuis weg. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 6 minuten. Plaats de kolom in een schoon microcentrifugebuisje van 1,7 ml en gooi het verzamelbuisje met de doorstroom weg. Voeg 20 μL water van moleculaire kwaliteit toe aan het midden van het kolommembraan voor elutie, sluit het deksel en incubeer de monsters met het water van moleculaire kwaliteit bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 1 minuut. Bewaren bij 4 °C voor kortstondige opslag of -20 °C voor langdurige opslag. Bevestig de afwezigheid van RNA-besmetting in het RNase-verteerde monster met eindpunt PCR of dPCR of kwantitatieve PCR (qPCR) met behulp van een PCR-primerpaar dat een mRNA-gebied zou amplificeren dat meerdere exonen omvat en niet slechts een enkel exon.OPMERKING: Het mRNA-doelwit moet van een gen zijn dat sterk tot expressie komt in het doelweefsel/celtype om ervoor te zorgen dat de mRNA-besmetting correct wordt geïdentificeerd indien aanwezig. Amplicons die meerdere exonen overspannen, maken onderscheid tussen banden die het gevolg zijn van het besmetten van mRNA versus genomisch DNA. Zorg altijd voor een niet-RNase verteerd DNA-monster als positieve controle voor de PCR-reactie om ervoor te zorgen dat mRNA-besmetting wordt gedetecteerd indien aanwezig. Digitale PCR (dPCR)Eindpunt PCR om de specificiteit van primers en optimale PCR-omstandigheden te controleren (optioneel)Ontwerp dPCR-primerparen en sondes voor het vectorgenoom en dPCR-primerparen en sondes voor het muisreferentiegen die zullen worden gebruikt om de diploïde genomen in het monster te kwantificeren.OPMERKING: Streef naar een amplicongrootte tussen 60 bp en 150 bp. Het referentiegen voor muizen moet een gen zijn met een constant aantal genkopieën per diploïde genoom. Voor de hier genoemde berekeningen heeft het referentiegen (Polr2a) twee kopieën per diploïde genoom. Voor een PCR-reactie met een eindpunt van 10 μl bereidt u het PCR-mengsel met behulp van de reagentia en de uiteindelijke concentraties die later voor de dPCR-reactie zullen worden gebruikt. Voeg het RNase-verteerde sjabloon-DNA-monster (hoeveelheidsbereik van nucleïnezuren 56-223 ng) toe aan een eindconcentratie van 1x dPCR-mastermix die de DNA-polymerase en dNTP’s bevat, 0.8 μM van elke voorwaartse primer, 0.8 μM van elke omgekeerde primer, 0.4 μM van elke sonde en 0.025 E/μL restrictie-enzym (uiteindelijke concentratie van restrictie-enzym is afhankelijk van het gebruikte restrictie-enzym en merk). Voeg water van moleculaire kwaliteit toe om een eindvolume van 10 μl te bereiken.OPMERKING: Er moeten ten minste twee primerparen en twee sondes in de PCR-mix zitten: een primerpaar en een sonde om het vectorgenoom te detecteren en een primerpaar en een sonde om het muizengenoom te detecteren. PCR thermische cyclusomstandigheden: Eerste warmteactiveringsstap bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 35-45 cycli van een denaturatiestap bij 95 °C gedurende 25 s en een gecombineerde gloei-/extensiestap bij 58-62 °C gedurende 1 min.OPMERKING: De optimale gloeitemperatuur moet voor elk amplicon- en primerpaar worden bepaald. Het aantal cycli kan worden aangepast aan de hoeveelheid sjabloon-DNA in het monster. Visualiseer het PCR-product op een agarosegel met behulp van gelelektroforese om de aanwezigheid van de doelampliconbanden en eventuele niet-specifieke amplificatiebanden te bepalen. Ga verder met de volgende dPCR-stap nadat u hebt bevestigd dat de primerparen en cyclusomstandigheden resulteren in specifieke amplificatie van de doelsequenties. dPCR-reactieVoeg voor een dPCR-reactie van 40 μl tot 4 μl van het RNase-verteerde sjabloon-DNA-monster (hoeveelheidsbereik nucleïnezuren 50-330 ng) toe aan een eindconcentratie van 1x dPCR-mastermix die de DNA-polymerase en dNTP’s bevat, 0,8 μM van elke voorwaartse primer, 0,8 μM van elke omgekeerde primer, 0,4 μM van elke sonde, en 0,025 E/μL restrictie-enzym (de uiteindelijke concentratie van het restrictie-enzym is afhankelijk van het gebruikte restrictie-enzym en het gebruikte merk). Voeg water van moleculaire kwaliteit toe om een eindvolume van 40 μl te bereiken. dPCR thermische cyclusomstandigheden: Eerste warmteactiveringsstap bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40-50 cycli van een denaturatiestap bij 95 °C gedurende 25 s, en een gecombineerde gloei-/extensiestap bij 58-62 °C gedurende 1 minuut.OPMERKING: De optimale gloeitemperatuur moet voor elk amplicon- en primerpaar worden bepaald. Het aantal cycli kan worden aangepast aan de hoeveelheid sjabloon-DNA in het monster. De volumes, concentraties en omstandigheden die hier worden vermeld, zijn geoptimaliseerd voor dPCR-platen, reagentia en apparaten die worden vermeld in de materiaaltabel. Deze omstandigheden verminderen het effect van mogelijke dPCR-remmers die de nauwkeurigheid van de reactie kunnen verminderen. Na het uitvoeren van de dPCR-reactie en het verkrijgen van de absolute waarden voor de vectorgenomen en het referentiegen van muizen, berekent u vg/dg in het monster met behulp van vergelijkingen (7-8).Voor referentiegenen met twee genkopieën/diploïde genoom:Absolute waarde van diploïde genomen (dg) = (7)vg/dg = (8) Controleer het 1D-spreidingsdiagram van de dPCR-reactie om de geldigheid van de test en kwantificering te bevestigen (Figuur 3A,C). Om de test geldig te laten zijn, moet u bevestigen dat het 1D-spreidingsdiagram aan alle volgende criteria voldoet: de aanwezigheid van positieve en negatieve partities; duidelijke scheiding tussen de positieve en negatieve partities om een nauwkeurige bepaling van de drempelwaarde mogelijk te maken; en de aanwezigheid van niet-tot-weinig druppeltjes tussen de positieve en negatieve partities (ook wel regen genoemd), wat de nauwkeurigheid van de dPCR-kwantificering kan verminderen.