Het voorbereiden van een muizenmodel van ernstige acute pancreatitis via een combinatie van caeruleïne en lipopolysaccharide intraperitoneale injectie
Summary
Intraperitoneale toediening van geneesmiddelen is een veilige en effectieve niet-invasieve benadering voor het induceren van pancreasletsel. Deze studie vergeleek vijf verschillende intraperitoneale injectieprotocollen bij muizen om verschillende gradaties van pancreasletsel te induceren en stelde een model van ernstig pancreasletsel vast om de pathologische veranderingen en behandelingsstrategieën voor ernstige acute pancreatitis (SAP) te onderzoeken.
Abstract
De behandeling van ernstige acute pancreatitis (SAP), met hoge sterftecijfers, vormt een aanzienlijke klinische uitdaging. Het onderzoeken van de pathologische veranderingen die verband houden met SAP met behulp van diermodellen kan helpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen en het verkennen van nieuwe behandelingsbenaderingen. Eerdere studies veroorzaakten voornamelijk pancreasbeschadiging door retrograde galweginjectie van natriumtaviaurocholaat, maar de impact van chirurgische schade op de kwaliteit van het diermodel blijft onduidelijk. In deze studie gebruikten we verschillende frequenties van intraperitoneale caeruleïne-injecties in combinatie met verschillende doses LPS om pancreasletsel te induceren bij C57BL/6J-muizen en vergeleken we de mate van letsel in vijf intraperitoneale injectieprotocollen. Met betrekking tot het induceren van acute pancreatitis bij muizen wordt een intraperitoneaal injectieprotocol voorgesteld dat resulteert in een sterftecijfer van maar liefst 80% binnen 5 dagen. Concreet kregen muizen tien dagelijkse intraperitoneale injecties met caeruleïne (50 μg/kg), gevolgd door een injectie met LPS (15 mg/kg) een uur na de laatste toediening van caeruleïne. Door de frequentie en dosering van geïnjecteerde medicijnen aan te passen, kan men de ernst van pancreasletsel effectief manipuleren. Dit model vertoont een sterke controleerbaarheid en heeft een korte replicatiecyclus, waardoor het door een enkele onderzoeker kan worden voltooid zonder dat er dure apparatuur nodig is. Het simuleert gemakkelijk en nauwkeurig de belangrijkste ziektekenmerken die worden waargenomen in menselijk SAP, terwijl het een hoge mate van reproduceerbaarheid aantoont.
Introduction
Ernstige acute pancreatitis wordt gekenmerkt door een snel begin, snelle progressie en hoge sterftecijfers binnen het domein van de ziekte van het spijsverteringsstelsel1. Het hoge sterftecijfer is altijd een prominente focus geweest van klinisch onderzoek. Vanwege onvoorspelbare veranderingen in klinische omstandigheden, heterogeniteit van ziekteverschijnselen en beperkte beschikbaarheid van menselijke monsters, is het opzetten van diermodellen steeds belangrijker geworden voor ziekteonderzoek.
Retrograde injectie van natriumtaurocholaat in het gemeenschappelijke galkanaal wordt vaak gebruikt om een rattenmodel van SAP2 te creëren. Door pancreaticobiliaire obstructie te simuleren en reflux van gal en pancreasvloeistof te induceren, vertoont deze modelleringstechniek een hoog slagingspercentage bij het repliceren van SAP-diermodellen. Er moet echter worden opgemerkt dat invasieve chirurgie wel een impact heeft op het diermodel zelf. Bovendien is deze methode beperkt tot grotere dieren, zoals ratten en honden, die voornamelijk als proefpersonen worden gebruikt. Alternatieve technieken, waaronder intubatie van de twaalfvingerige darm3, directe twaalfvingerige darmpunctie4 en directe punctie van de galweg-pancreasbuis5, worden vaak gebruikt voor modelleringsdoeleinden.
Intraperitoneale injectie en dieetmodelleringsmethoden bieden niet-invasieve voordelen die kunnen worden toegepast op dieren van elke grootte. Het muismodel van SAP geïnduceerd door het voeren van choline-deficiënt-ethionine (CDE)6 vertoont bepaalde complicaties, zoals slecht controleerbare hyperglykemie en hypocalciëmie, waardoor het ongeschikt is voor het evalueren van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen. Aan de andere kant is intraperitoneale injectie van caeruleïne in combinatie met L-arginine7 de meest gebruikte methode voor het induceren van acute pancreatitis bij muizen. Met name herhaalde intraperitoneale toediening van caeruleïne – een cholecystokinine-analoog – biedt een zeer geschikte benadering voor het onderzoeken van verschillende aspecten die verband houden met deze destructieve ziekte, waaronder pathogenese, ontsteking en regeneratieprocessen. Vanwege de structurele gelijkenis met cholecystokinine (CCK), stimuleert caeruleïne effectief de samentrekking van de galblaas en de secretie van pancreasenzymen, wat leidt tot een onbalans in de enzymsecretie, gevolgd door daaropvolgende zelfvernietiging8. Lipopolysaccharide (LPS), dat alomtegenwoordig is en uitgebreid wordt bestudeerd als een pathogeen-geassocieerd moleculair patroonmolecuul, kan via intraperitoneale injectie worden gecombineerd met caeruleïne om een effectief muizenmodel van SAP op te zetten. Deze combinatie activeert snel een aanzienlijk aantal inflammatoire cytokines en geeft deze vrij, wat resulteert in overmatige lokale en systemische ontsteking. Verschillende onderzoeken hebben de inductie van SAP-modellen bij muizen gerapporteerd door intraperitoneale injectie van caeruleïne in combinatie met LPS. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat intraperitoneale injectie van caeruleïne pancreasoedeem en bloeding bij muizen kan veroorzaken, terwijl de toevoeging van LPS onmiddellijk pancreasnecrose kan induceren en systemische ontstekingsreacties, sepsis en zelfs orgaanfalen kan verergeren. Momenteel is er variatie in de dosering en frequentie van intraperitoneale caeruleïne-injecties, evenals inconsistentie in aanvullende LPS-dosering. Het bereiken van consistentie in SAP-muismodellen is een uitdaging 9,10,11,12; Daarom is het noodzakelijk om een gestandaardiseerd protocol op te stellen voor het verkrijgen van een ideaal model. In dit artikel beschrijven we een protocol voor intraperitoneale injectie bij muizen en onderzoeken we de optimale injectiefrequentie en aanvullende dosering van LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Momenteel is er een gebrek aan effectieve middelen om het hoge sterftecijfer bij patiënten met ernstige acute pancreatitis te verbeteren. Het is van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen bij het verbeteren van de immuunstabiliteitsmechanismen te onderzoeken. Er is dringend behoefte aan een ideaal diermodel voor ernstige acute pancreatitis. Muizen met een C57BL/6J genetische achtergrond worden veel gebruikt in biomedisch onderzoek, waaronder studies naar SAP-pathofysiologie. Meer dan 70 jaar genetische di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door Research Projects in Health and Medical Science in Huainan City (nr. HNWJ2023005); Gemeentelijk begeleidend wetenschaps- en technologieplanprogramma in Huainan City (nr. 2023151); Trainingsprogramma voor innovatie en ondernemerschap van studenten van het Anhui Provincial College (nr. S202310361254); De negende lichting van de “50· Sterren van wetenschap en technologie” innovatieteams in Huainan City en Anhui Provincial Key Clinical Specialty Construction Project. We willen onze dank uitspreken aan de laboratoriumafdeling van het First Affiliated Hospital van de Anhui University of Science and Technology voor het verstrekken van de relevante testgegevens.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
References
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777 (2022).
- Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
- Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
- Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
- Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
- Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685 (2017).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 1192-1204 (1985).
- Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754 (2019).
- Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470 (2022).
- Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928 (2021).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
- Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
- Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585 (2021).
- Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
- Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363 (2023).
- Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455 (2023).
- Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
- Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
- Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
- Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).
.