تحضير نموذج الفئران لالتهاب البنكرياس الحاد الوخيم عن طريق مزيج من حقن القيرولين وعديس السكاريد الشحمي داخل الصفاق
Summary
إدارة الدواء داخل الصفاق هو نهج غير جراحي آمن وفعال للحث على إصابة البنكرياس. قارنت هذه الدراسة خمسة بروتوكولات متميزة للحقن داخل الصفاق على الفئران للحث على درجات متفاوتة من إصابة البنكرياس وأنشأت نموذجا لإصابة البنكرياس الشديدة للتحقيق في التغيرات المرضية واستراتيجيات العلاج لالتهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP).
Abstract
يشكل علاج التهاب البنكرياس الحاد الوخيم (SAP) ، مع ارتفاع معدلات الوفيات ، تحديا سريريا كبيرا. يمكن أن يساعد التحقيق في التغيرات المرضية المرتبطة ب SAP باستخدام النماذج الحيوانية في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة واستكشاف طرق العلاج الجديدة. الدراسات السابقة تسببت في المقام الأول في إصابة البنكرياس من خلال حقن القناة الصفراوية إلى الوراء من taviaurocholate الصوديوم ، ولكن تأثير الضرر الجراحي على جودة النموذج الحيواني لا يزال غير واضح. في هذه الدراسة ، استخدمنا ترددات مختلفة من حقن Caerulein داخل الصفاق جنبا إلى جنب مع جرعات مختلفة من LPS للحث على إصابة البنكرياس في الفئران C57BL / 6J وقارنا مدى الإصابة عبر خمسة بروتوكولات حقن داخل الصفاق. فيما يتعلق بإحداث التهاب البنكرياس الحاد في الفئران ، يقترح بروتوكول الحقن داخل الصفاق الذي يؤدي إلى معدل وفيات يصل إلى 80٪ في غضون 5 أيام. على وجه التحديد ، تلقت الفئران عشر حقن يومية داخل الصفاق من Caerulein (50 ميكروغرام / كجم) ، تليها حقنة LPS (15 مجم / كجم) بعد ساعة واحدة من آخر إعطاء Caerulein. من خلال ضبط وتيرة وجرعة الأدوية المحقونة ، يمكن للمرء أن يتلاعب بشدة إصابة البنكرياس بشكل فعال. يظهر هذا النموذج قدرة تحكم قوية وله دورة نسخ متماثل قصيرة ، مما يجعله ممكنا لإكماله من قبل باحث واحد دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن. إنه يحاكي بشكل ملائم ودقيق خصائص المرض الرئيسية التي لوحظت في SAP البشري مع إظهار درجة عالية من التكاثر.
Introduction
يتميز التهاب البنكرياس الحاد الوخيم ببداية سريعة وتطور سريع ومعدلات وفيات عالية في مجال أمراض الجهاز الهضمي1. لطالما كان معدل الوفيات المرتفع محورا بارزا للبحوث السريرية. نظرا للتغيرات غير المتوقعة في الظروف السريرية ، وعدم تجانس مظاهر المرض ، ومحدودية توافر العينات البشرية ، أصبح إنشاء نماذج حيوانية أمرا بالغ الأهمية بشكل متزايد لأبحاث الأمراض.
يشيع استخدام الحقن الرجعي لتوروكولات الصوديوم في القناة الصفراوية المشتركة لإنشاء نموذج فئران من SAP2. من خلال محاكاة انسداد البنكرياس الصفراوي وإحداث ارتجاع الصفراء والسائل البنكرياسي ، تظهر تقنية النمذجة هذه معدل نجاح مرتفع في تكرار نماذج SAP الحيوانية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الجراحة الغازية لها تأثير على النموذج الحيواني نفسه. علاوة على ذلك ، تقتصر هذه الطريقة على الكبيرة ، مثل الجرذان ، والتي تستخدم في المقام الأول كمواضيع تجريبية. كثيرا ما تستخدم التقنيات البديلة ، بما في ذلك التنبيب الاثني عشر3 ، وثقب الاثني عشر المباشر4 ، والبزل المباشر للقناة الصفراويةوالبنكرياس 5 ، لأغراض النمذجة.
يوفر الحقن داخل الصفاق وطرق النمذجة الغذائية مزايا غير جراحية يمكن تطبيقها على من أي حجم. نموذج الفأر من SAP الناجم عن تغذية نقص الكولين الإيثيونين (CDE)6 يقدم بعض المضاعفات, مثل ارتفاع السكر في الدم لا يمكن السيطرة عليه ونقص كلس الدم, مما يجعلها غير مناسبة لتقييم الأساليب التشخيصية والعلاجية الجديدة. من ناحية أخرى ، يمثل الحقن داخل الصفاق من Caerulein جنبا إلى جنب مع L-arginine7 الطريقة الأكثر استخداما لإحداث التهاب البنكرياس الحاد في الفئران. على وجه التحديد ، يوفر الإعطاء المتكرر داخل الصفاق ل Caerulein – وهو نظير cholecystokinin – نهجا مناسبا للغاية للتحقيق في الجوانب المختلفة المتعلقة بهذا المرض المدمر ، بما في ذلك عمليات التسبب في المرض والالتهاب والتجديد. نظرا لتشابهه الهيكلي مع كوليسيستوكينين (CCK) ، يحفز Caerulein بشكل فعال تقلص المرارة وإفراز إنزيم البنكرياس ، مما يؤدي إلى خلل في إفراز الإنزيم يليه تدمير ذاتي لاحق8. عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، الذي يتم نشره في كل مكان ودراسته على نطاق واسع كجزيء نمط جزيئي مرتبط بمسببات الأمراض ، يمكن دمجه مع Caerulein عن طريق الحقن داخل الصفاق لإنشاء نموذج فئران فعال ل SAP. يؤدي هذا المزيج بسرعة إلى إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية وإطلاقه ، مما يؤدي إلى التهاب موضعي وجهازي مفرط. أبلغت العديد من الدراسات عن تحريض نماذج SAP في الفئران من خلال الحقن داخل الصفاق من Caerulein جنبا إلى جنب مع LPS. قد يعزى ذلك إلى حقيقة أن الحقن داخل الصفاق من Caerulein يمكن أن يسبب وذمة البنكرياس ونزيف في الفئران ، في حين أن إضافة LPS يمكن أن تحفز على الفور نخر البنكرياس وتفاقم الاستجابة الالتهابية الجهازية والإنتان وحتى فشل الأعضاء. حاليا ، هناك اختلاف في جرعة وتواتر حقن Caerulein داخل الصفاق وكذلك عدم الاتساق في جرعة LPS الإضافية. يمثل تحقيق الاتساق في نماذج SAP للماوس تحديا9،10،11،12 ؛ لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول موحد للحصول على نموذج مثالي. في هذه المقالة ، وصفنا بروتوكولا للحقن داخل الصفاق في الفئران والتحقيق في تردد الحقن الأمثل والجرعة الإضافية من LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاليا ، هناك نقص في الوسائل الفعالة لتحسين معدل الوفيات المرتفع في المرضى الذين يعانون من التهاب البنكرياس الحاد الوخيم. من الأهمية بمكان التحقيق في فعالية الأدوية في تعزيز آليات الاستقرار المناعي. توجد حاجة ملحة لنموذج حيواني مثالي لالتهاب البنكرياس الحاد الشديد. تستخدم الفئران ذات الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال مشاريع بحثية في مجال الصحة والعلوم الطبية في مدينة هواينان (No. HNWJ2023005) ؛ برنامج خطة العلوم والتكنولوجيا التوجيهية البلدية في مدينة هواينان (رقم 2023151) ؛ برنامج التدريب على الابتكار وريادة الأعمال لطلاب كلية مقاطعة آنهوي (رقم S202310361254) ؛ الدفعة التاسعة من “50· نجوم العلوم والتكنولوجيا” فرق الابتكار في مدينة هواينان ومشروع البناء التخصصي السريري الرئيسي في مقاطعة آنهوي. نود أن نعرب عن امتناننا لقسم المختبرات في المستشفى التابع الأول لجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا لتوفير بيانات الاختبار ذات الصلة.
Materials
| 20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1202-250 ml | |
| Amylase | Mindray,China | ||
| Annexin V-FITC/PI | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1511 | diluted at 1:20 |
| Anti-HMGB1 Rabbit pAB | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1800 |
| BCA protein quantitative detection kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2026-200T | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA | BD FACSCanto II | |
| BSA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305010-100g | |
| C57BL/6J | Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China | license number SCXY (Su) 2011–0003 | |
| Ceruletide | MCE, New Jersey, USA | 17650-98-5 | 50 µg/kg |
| Chemiluminescence imager | Cytiva CO.,LTD.;USA | ||
| Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1201-5 L | |
| Collagenase IV | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC305014 | 0.5 mg/mL |
| DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100 T | |
| Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System | Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA | YZB/USA 8311-2014 | |
| ECL developer | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | ||
| Eosin dye (alcohol soluble) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1001-100 ml | |
| EthoVision XT | Noldus, Netherlands | ||
| FITC-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB22303 | diluted at 1:50 |
| Fully automatic blood cell analyzer | Zybio Inc. China | Zybio-Z3 CRP | |
| GapDH | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB11103 | diluted at 1:1500 |
| Hematoxylin blue return solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1040-500 ml | |
| Hematoxylin differentiation solution | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1039-500 ml | |
| Hematoxylin dye | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1004-100 ml | |
| HMGB-1 ELISA kits | njjcbio Co., Ltd, China | ||
| HOMOGENIZER | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | KZ-III-F;IC111150 100222 | |
| HRP-labeled goat anti-rabbit IgG | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GB23303 | diluted at 1:1500 |
| IL-6 ELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0001 | |
| Lipase | Mindray,China | ||
| Lipopolysaccharide | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GC205009 | 15 mg/kg |
| Low temperature high speed centrifuge | Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China | TGL-20M | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1204 | |
| microtome | Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China | CR-601ST | |
| Nylon mesh | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | 200-mesh | |
| One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G1507-100T | |
| Paraffin tissue embedding machine | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PBM-A | |
| Pathological tissue drying apparatus | PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China | PHY-III | |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G4202-100ML | |
| PMSF | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2008-1 ml | |
| Positive fluorescence microscope | Olympus Corporation,Tokyo, Japan | BX53 | |
| Pro Calcitonin | Mindray,China | ||
| PVDF membrane | Millipore, USA | 0.22 µm | |
| RIPA | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | G2002-100 ml | |
| SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology,China | P0012A | |
| TNF-αELISA kits | Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China | GEM0004 | |
| Ultrasonic water bath | DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China | KQ-200KDE | |
| Western Blot | Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA | ||
| Western blot imaging System | Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN | Amersham ImageQuant 800 | |
| Whirlpool mixer | SCILOGEX;USA |
References
- Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
- Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777 (2022).
- Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
- Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
- Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
- Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
- Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685 (2017).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 1192-1204 (1985).
- Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754 (2019).
- Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470 (2022).
- Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928 (2021).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
- Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
- Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585 (2021).
- Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
- Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363 (2023).
- Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
- Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
- Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455 (2023).
- Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
- Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
- Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
- Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).
.