下部双翅目バエ Bradysia(Sciara)coprophilaの実験室維持:新/古い新興モデル生物

ここで説明するプロトコルは、Charles Metz、Helen Crouse、Susan Gerbiが順番に監督する Bradysia (Sciara)ストックセンターからの100年の経験と、他の人からの意見を表しています。 1.交配クロス 直径28mmのガラスバイアルごとに1人の成人女性と2人の成人男性を使用してください。.娘や息子だけを持つ母親の翼の表現型を認識することに100%成功したら、バイアルごとに2匹のメスと2匹のオスを使用して、幼虫/バイアルの数を増やします。女性よりも麻酔から早く目覚める男性を追加する前に、各バイアルに女性を追加します。注:以下の説明は、CO2があることを前提としています。あるいは、エーテルを使用して成虫のハエを麻酔することもできます。 エーテルを使用して成虫のハエを麻酔する場合は、折りたたまれた実験室用ワイプ(例:.、キムワイプ)のパッドをCoplinジャーの丸いガラス蓋の内側にテープで固定し、スポイトを使用してボトルからエーテルを移し、実験室のワイプパッドを湿らせます(ただし、飽和しておらず、エーテル液が落ちてハエを溺死させるリスクがあるほど濡れていません)。以下のステップ1.6では、湿らせたエーテルパッドを開いたバイアルの上に~1分間置き、成虫の動きが止まるまで待ちます。成虫を白いセラミックタイルプレート(白いフライパッドの代わりに使用)に移したら、定期的に(ハエの足がけいれんし始めたら)エーテルで湿らせたばかりのパッドをプレート上のハエの上に(触れないように)~1分間保持します。注意: エーテルは可燃性であるため、冷蔵庫ではなく換気フードに保管する必要があります。 腕の届くところに、成人女性のバイアルが入ったトレイ、成人男性のトレイ、2.2%(wt/vol)寒天が入った空のバイアルが入ったトレイを配置します。実験室のベンチに、「女性」または「男性」と母親の翼の表現型を記載したプラカードノートを置き、交配のために選択された大人のバイアルが正しいグループに配置され、一方のグループのすべてのバイアルが男性の子孫のみを持ち、もう一方のグループのすべてのバイアルが女性の子孫を持つようにします。注意: 成虫が液滴に付着するため、バイアル内に結露液滴が入っていないことを確認してください。バイアルをプラスチックの箱に保管していた場合は、使用前にバイアルを室温の実験台に少なくとも1時間置いて、結露を蒸発させます。 CO2ガスと解剖顕微鏡用のランプをオンにします。注:光ファイバーを備えた光源は、熱の放出が少なく、麻酔をかけたハエがより早く目覚めるため、好まれます。 大人と一緒にバイアルをゴムパッドで強くたたき、大人がバイアルの底に落ちてプラグを取り外すようにします。CO2 ガンノズルを挿入し、プラグを再度追加します。 ノズルトリガーを押し下げて、CO2 がバイアルに ~1 分間流れ込み、成人に麻酔をかけます。 フットペダルに足を乗せて、CO2 がガンノズルではなく白いフライパッドに流れるようにします。ハエが白いフライパッドにいる間、ずっとフットペダルを踏んだままにします(または、ハエの足がけいれんし始めるたびにフットペダルを断続的に押します)。 ノズルとプラグをバイアルから取り外し、解剖顕微鏡下で白いフライパッドの上にバイアルを反転させます。 逆さにしたバイアルの底を顕微鏡に当てて、成虫がバイアルから白いフライパッドに落ちるようにします。 最も太った成虫(最近は白い腹部で閉じられた)を選択し、先端の細い鉗子を使用して成虫の中足または後ろ足を優しく持ち上げます。交尾ダンスに使用される前足を傷つけないでください。閉じたばかりで、体が完全に白く、まだ黒くなっていない成虫は、翼が短く、完全に発達しておらず、翼の表現型をスコアリングできないため、使用しないでください。腹部がスリムな成人は、生殖能力が低下していますが、引き続き使用できます。翼が体から垂直に上げられている痩せた大人は死んでいるので使用しないでください。 一方、2.2%(wt / vol)寒天でバイアルからプラグを取り出します。成虫と一緒に鉗子を持っている手で、成虫がバイアルの底に落ちるように、バイアルの上部内壁に対して鉗子を強くたたいます。プラグをバイアルに交換します。 上記の手順1.5〜1.11を繰り返して、女性の成人が入った各バイアルをセットアップします。絵筆を使用して、未使用のハエを白いフライパッドから親バイアルに戻します。親バイアルのラベルにチェックマークを付けて、嵌合に使用されたことを示します(ただし、必要に応じて再度使用できます)。 定期的なストックメンテナンスのために、女性生産者の母親に6〜8本のバイアルを、男性の母親に6〜8本のバイアルを設定します(図4)。バイアルの半分を1つの大人用バイアルの母親(または父親)でセットアップし、新しいバイアルの残りの半分を別の大人用バイアルを使用してセットアップして、遺伝的ボトルネックを最小限に抑えます。時折、誤った分離イベントにより、女性を生産するバイアルで例外的な男性が生まれます。成体の女性の入ったバイアルに例外的なオスがいる場合は、そのオスを取り出してつぶして殺します。可能であれば、そのバイアルからすべての雌を捨て、より多くの成体の雌が閉じて安全に交配に使用できるようになるまで数日待ちます。注:そのバイアルのメスを交配に使用しないことが望ましいです。なぜなら、彼らは例外的なオスと交配し、肥沃なクロスを産まなかったかもしれないからです。 成体の雌をすべてのバイアルに加えたら、手順1.5〜1.11を繰り返して、すでに雌のハエが入っている各バイアルに2匹の成体の雄(図4)を追加します。メスがゴムパッドでバイアルを軽くたたき、2人のオスが連続して追加されたときにメスが逃げないようにします。注:迅速に作業し、成虫のハエを過度に麻酔をかけないでください。 各バイアルにラベルを追加し、ストック、交配(雌または雄の子孫)、母親が成体のバイアル#1または#2から来たかどうか、および交配の日付を示します。また、上記の情報をノートブックに入力し、各クロスに設定されたバイアルの数を記入します。注:トレイ内の男性生産バイアルと女性生産バイアルを分離するためにペーパータオルを追加すると便利です。 バイアルをカウンタートップに~15分間放置して、成虫が目を覚まして飛び回ることを確認します。彼らが交尾しているかどうかを観察します(目覚めた直後に)、メスとオスが後方を向いている場所(オスのクラスパーがメスの先のとがった産卵管をつかむ)(図4、下)。注:成体の女性は成体の雄を一度だけ受け入れるので、交配の過程で雄と雌を分離する可能性があり、その雌が再交配しない可能性があるため、交配後にバイアルをぶら動かさないでください。 嵌合したバイアルを入れたトレイをインキュベーター(例:21°C)に置きます。トレイにストックの名前(HoLo2など)と5週間サイクルの週(1、2、3、4、または5週)のラベルを付けます。注:嵌合したばかりのハエが入ったトレイをインキュベーターまたは別のインキュベーターの別の部分に保管して、幼虫が出現するまでバイアルに給餌しないように注意してください(以下で説明します)。 2.大量交配 注:通常、単一の B.コプロフィラ の母親は、彼女のひなに60の子孫を産みます。実験により多くの子孫が必要な場合、上記の一対の交配の代わりに大量交配を行うことができます。大量交配は、標準的な直径28cmのガラスバイアルで行うことができ、母親は翌日に人工産卵と胚収集のために収集されます。ただし、より多くの幼虫が必要な場合は、過密を防ぐために、より大きな表面の瓶で大量交配が行われます。瓶の蓋にいくつかの小さな穴を開けて、幼虫が呼吸するための空気を得ることができるようにします。 上記のセクション1の手順に従いますが、先端の細い鉗子を使用して、すべての女性生産者の母親(またはすべての男性生産者の母親)を白いフライパッドの前隅に移動します。10〜15人の麻酔をかけた太った成人女性を使用し、このグループを絵筆でバイアルまたは蓋に小さな穴を開けた瓶に一掃します。メモ: 手順 2.1 と 2.2 を実行します。肥沃な交配を防ぐ過麻酔を避けるために、大量交配を迅速に行います。 20-25人の麻酔をかけた太った成人男性を選択し、先端の細い鉗子で白いフライパッドの前隅に移動します。 プラグまたは蓋を取り外して、白いフライパッドから成人男性の麻酔をかけたクラスターをペイントブラシで掃引するときに逃げないように、メスと一緒にバイアルまたはジャーをゴムパッドで強くたたきます。 3. 大量交配後の胚採取 交配の1日後(24時間)に、ステップ1.5-1.11を実行して成虫のハエ(雌と雄の混合物)に麻酔をかけ、それらを白いフライパッドに移します。注:成虫が交尾したとき、卵形成はまだ完了しておらず、それが終末減数分裂を引き起こします。成熟した卵子は、卵子が排出されるときに精子に蓄えられた精子によって受精する 29。卵形成の完了には1〜2日かかるため、交配後1日は産卵が誘発されます。 先端の細い鉗子で、成虫のメスを翼で拾い上げ、2.2%(wt/vol)の寒天を含む直径100mmのシャーレに置き、翼を寒天に挿入します。白いフライパッド上の各成体女性について、この手順を順番に繰り返します。フライパッドの成体オスを捨てます。 すべての雌のハエが寒天に突き刺さったら、雌のハエが発作のような動きをするまで、鉗子で頭を優しく絞って産卵を誘発します。または、胸郭をそっと絞ってください。その後、彼女は30〜60分以内に受精卵のクラスターを産みます。水で湿らせた蓋でペトリ皿を覆いますamp蓋への卵の静電引力の蓋への卵の引力を防ぐために。 4. 幼虫の「ハッチ」の確認 交尾から1週間後に幼虫の「ハッチ」を確認します。バイアルからプラグを取り外し、解剖顕微鏡を使用して幼虫のスコアを付けます。彼らの黒い顎は開閉を繰り返し、ゆっくりと前進します。幼虫が数匹しかいない場合は、バイアルのラベルに「少数」と書いて、そのバイアルの給餌量を減らすように注意してください。その十字架のあるトレイ内の各バイアルを調べ、ノートブックの幼虫の入ったバイアルの数を、その交配で設定されたバイアルの数の隣の列に入力します。注:濃い黄色の卵は発生しません。白い卵が発達する可能性が高く、幼虫が出現する1日前に、卵の前端に黒い色素(将来の顎)が発生します。カビの端が黒い球で終わる白いフィラメントのカビを幼虫と間違えないでください-寒天の上を前方に這う幼虫とは異なり、カビは動きません。 幼虫の入った各バイアルに少量のストローを(一度だけ)追加して、過剰な湿度を制御し、幼虫の隠れ場所を提供します。 トレイをインキュベーター(例:21°C)に移動し、前の週の交配交配からの幼虫のトレイを入れ、新しく出現した幼虫をバイアルに給餌し始めます(給餌に関する以下のセクションを参照)。注:通常、幼虫は死んだ母親の近くに集まり、彼女を食べ始めます。おそらく、これにより酵母が母親の腸から幼虫の腸に移されます。幼虫が出てきた日、またはその後2日以内に給餌を開始できます。注意:給餌が遅れると、幼虫はお互いを食べ合い、バイアルごとに1匹の太った幼虫だけが残ります。 週に3日間、まだ幼虫がいなかったバイアルをチェックし続けます。7〜10日後に幼虫が出現しない場合は、バイアルを廃棄するか、バイアルの洗浄のために保管してください。 5. 料理を作る 注:すべての食品成分は無農薬でなければなりません! 大さじを使用して、次の材料を体積で測定し、金属鍋またはガラス鍋(8インチx 8インチの金属製ベーキングパンなど)に入れます:オーツ麦ストロー4部(大さじ8)、椎茸粉末2部(大さじ4)、ほうれん草粉末1部(大さじ2)、イラクサ粉末1部(大さじ2)。大さじを使って鍋で材料をよく混ぜます。注:あるいは、ほうれん草の粉末だけまたはイラクサの粉末をそれぞれ1部の代わりに2部を使用することもできます。 鍋をアルミホイルで覆い、オートクレーブで乾式サイクルで20〜30分間。一晩以上室温まで冷まします。 フライパンからホイルを取り出し、固まった滅菌食品混合物を砕き、大さじで粉砕運動を使用して粉末状の混合物を作成します。 ビール酵母1部(山盛り大さじ2)を加え、オートクレーブ滅菌した食品混合物によく混ぜます。注:Brewer’s yeastはオートクレーブ処理されていないため、酵母が死滅します。 食品混合物を滅菌キャップ付きジャーに移します。注:大量交配に使用したのと同じタイプの240mLジャーを使用でき、上記のレシピでジャーが満たされます。同様に、同じタイプの滅菌キャップ付きジャーには、ホイルで覆われたパンでオートクレーブされたストローだけを充填する必要があります。 6.給餌 注:幼虫の年齢と量に応じて、与えられる食物の量を調整します。大量交配からの多くの幼虫が入った瓶にたくさんの食べ物を与えます。発生病期分類のために数日間保存されている幼虫を入れたペトリプレートに食べ物を軽く振りかけるだけです。以下に述べる給餌方法は、チャールズ・メッツ 29の研究室で開発され、彼の研究室やヘレン・クラウス、スーザン・ガービなどによって1世紀にわたって成功裏に使用されてきました。 手を洗い、よくすすいで石鹸を取り除きます。注:手袋は、各バイアルに与えられる食物の量を調整するための指の感触を低下させるため、お勧めしません。 挽いたストローが入った蓋付きの滅菌瓶と、幼虫が保管されているインキュベーター(例:21°C)に餌が入った滅菌瓶を保管します。瓶から蓋を外し、きれいなボウル(キャンディー皿など)に食べ物を注ぎます。残りの食品が入った瓶の蓋を元に戻します。開いたボウルに食べ物を入れて、金属製またはガラス製の小さなトレイに入れておきます。これにより、ダニや他の昆虫がトレイの壁を這いずり回って食べ物と一緒にボウルに入るのを防ぎます。 2本目の指と3本目の指の間(または親指と2本目の指の間)で食べ物を拾います。もう一方の手で、トレイからバイアルを取り出し、プラグを取り外し、指で保持しながら給餌します。幼虫の年齢と数についてバイアルを調べ、食物を互いに保持している2本の指を回転させて、適切な量の食物をバイアルに沈殿させます。新しく出現した幼虫の入ったバイアルには、数粒の食物が必要です。古い幼虫の入ったバイアルには、寒天の上部を覆う薄い食物の層が必要です。 バイアルに白いカビがある場合は、実験室のワイプにスプレーした70%エタノールを使用して、長い金属プローブ(木製のハンドルなど)を拭き取り、プラグを取り外し、きれいなプローブをバイアルに挿入して寒天の表面のカビを軽くたたきます。カビが多い場合は、プローブを回転させてプローブに型を巻き付け、バイアルから取り出します。幼虫がそこに住んでいるので、寒天の上部を乱さないでください。少量の食物だけを追加し、バイアルのプラグを交換します。プローブを保管する前に、またはプローブを使用して別のバイアルを洗浄する前に、70%エタノールで強化したラボ用ワイプでプローブを拭いてください。 トレイ内のすべてのバイアルが供給されたら、インキュベーター内のトレイを交換し、ステップ6.3のように次のトレイを取り出して供給します。 給餌が完了したら、ボウルから残りの食物を以前に滅菌した瓶に注ぎ、瓶に蓋をしてインキュベーターに保管します。 7.ペトリプレート上の幼虫または蛹の収集 幼虫の数が少ない場合は、70%エタノールで拭いた金属プローブまたはスパチュラを使用してバイアル内の寒天の最上層を掘り、一部の幼虫が付着した付着した寒天を、2.2%(wt / vol)寒天で半分満たされた直径100mmの滅菌ペトリ皿に移します。 幼虫の数が多い場合は、バイアルの下部にある壁に沿ってへらを挿入して、寒天栓をバイアルから取り出し、空のペトリ皿に面を上にして堆積させます。解剖顕微鏡を使用して寒天プラグの上部にある幼虫を見つけ、先端の細い鉗子で2.2%(wt / vol)寒天を半分充填した直径100mmの滅菌ペトリ皿に移します。 解剖顕微鏡を使用して、先端が細い鉗子を持つ幼虫を同じ発生段階のグループに選別します。注:わずかな発達上の非同期性により、2.2%(wt / vol)寒天のペトリプレート上に選別された幼虫のいくつかの異なるクラスターがあります。 小さな食べ物をふりかけ、幼虫の入ったペトリ皿をインキュベーターに入れます。毎日取り外して、解剖顕微鏡で観察し、目的の発達段階を選択します。注:DNAパフ研究の場合、初期の眼点幼虫は、10×5、12×6、14×7、およびエッジアイ/ドロップジョーステージを経て、これらのステージのそれぞれで~1日経過します30,31。蛹の精巣に減数分裂IおよびII段階を持つために、目が1/4から1/2に色素で満たされている蛹を選択します。 8.幼虫の冷蔵室保管 バックアップとして、2週間連続の交配から得られた雌の幼虫のバイアル4本と雄の幼虫のバイアル4本を冷蔵室に保管してください。 バックアップストレージとして、初期の4番目の 幼虫(視力前段階)の幼虫に餌を与え、冷蔵室の棚の開いたトレイに入れます。これらのバイアルを月に一度だけ給餌してください。 2〜3か月後に、2週間連続の交配交配から16本のバイアルを寒さから取り出します(これをカレンダーにリマインダーとしてマークします)。インキュベーター(例:21°C)に入れて普通に給餌し、交配に使用するために成虫に成長させます。 バイアルを冷蔵室から取り出したら、初期の4番目の 幼虫が入った新しいバイアルのセットを冷蔵室に置いて、これらのバイアルがストックのバックアップとして常に利用できるようにします。注:冷蔵室での保管後の生存率は、さまざまな発達段階について体系的にテストされていませんが、私たちの経験では、初期の4番目の 幼虫の冷蔵保存がうまく機能することが明らかになっています。 9.バイアル洗浄 成虫が死亡した後(閉塞後2~3週間)、バイアルをインキュベーターから取り出し、60〜70°Cに1時間置いて、残っている生物を殺します。 コットンプラグを取り外し、プラスチックの箱に保管します。 へらを使用して、バイアルから寒天栓を廃棄物缶にこすり落とします。 バイアルを一晩またはそれ以上の時間を皿皿の水に浸します。 この目的のためだけに保存された試験管ブラシ(化学薬品や石鹸の入った容器には使用しないでください)を使用し、水道水が流れている状態でバイアルを上下にこすります。洗浄したバイアルを開いた面を下にして金属製のバスケットに入れます。バスケットに洗浄したバイアルを入れます。注:バイアルに石鹸は絶対に使用しないでください、残留石鹸は B.コプロフィラを殺す可能性があるためです。 バスケットに金網の蓋を追加し、蓋を所定の位置に保持しながら、バスケットを反転させて、すべてのバイアルを脱イオン水で満たします。蓋を所定の位置に保持したまま、バスケットを反転させて、バイアルから脱イオン水を空にします。脱イオン水すすぎを4回繰り返します。 洗浄したバイアルを入れたバスケットをペーパータオルまたはオープンメッシュプラットフォーム(例:.、ラボカート)で一晩以上乾燥させます。.ドライバイアルは引き出しに保管してください。注:死んだ大人のバイアルは、ダニの蔓延を招く可能性があるため、洗う前に長時間放置しないでください。 10.寒天を注ぐ 大きな容器(金属製のバスケットまたは金属製のトレイ)に清潔なバイアルを入れ、各バイアルに綿栓を追加します。バイアルを洗浄したときに古いバイアルから取り出したプラグを再利用し、プラグが劣化してバラバラになり廃棄するまで繰り返し使用します。プラグを差し込んだバイアルで容器を乾燥サイクルで~30分間滅菌し、室温まで冷ましてオートクレーブ容器に保管します。常に2つの容器(1つはアクティブに使用中、もう1つは予備)は、オートクレーブ処理されたプラグバイアルを手元に置いてください。 11.0 gの寒天粉末を1 Lの三角フラスコに入れ、500 mLの蒸留水を加えて、~24バイアル(~21 mL/バイアル)を注ぐのに十分な2.2%(wt/vol)の寒天溶液を作ります。フラスコを回して電子レンジに入れます。注:ここからは、耐熱オートクレーブグローブを使用してフラスコを取り扱います。必要に応じて、同じ2.2%(wt/vol)の寒天溶液をペトリプレート(摘み取った幼虫用)または瓶(大量交配用)に注ぐことができます。 電子レンジで1分間加熱し、フラスコを取り外して回転させ、電子レンジに入れ直して、再度1分間電子レンジで加熱します。これを数回繰り返します。 電子レンジのガラスドアからフラスコを眺めます。寒天溶液が泡立って沸騰し始めたら、すぐに手動停止ボタンを使用してください。この時点でフラスコを回さないでください(沸騰する可能性があります)オーブンからカウンターに慎重に取り出し、数分間休ませます。 滅菌したバイアルからプラグを取り出し、片手で持ちます。もう一方の手で、高さ2.5cm~2.2cmの寒天を滅菌したバイアルに注ぎます。次に、プラグをバイアルに交換します。すべての寒天が注がれるまでこれを繰り返します。注:バイアルに注がれる寒天が少なすぎると、使用中に乾燥が早くなり、バイアルの壁から収縮します。バイアルに寒天を注ぎすぎると、解剖顕微鏡で幼虫の「赤ちゃんの孵化」をスコアリングするときに最上層に焦点を合わせるのが難しくなります。 注がれたバイアルを室温で1〜2日間カウンターに置いて、寒天が硬化し、水分が完全に蒸発するようにします。バイアルを交配に使用するか、しっかりと蓋をしたプラスチックの箱に横向きに横にして保管します。水で湿らせたペーパータオルをバイアルの上に置いてから、蓋を箱に置きます(これにより、寒天が乾燥してバイアルの壁から縮むのを防ぎます)。注がれたバイアルを入れた箱は、室温で数日間、または4°Cの冷蔵庫または冷蔵室で最大2週間保管してください。保管されたバイアルを使用する前に、箱から取り出し、室温で1〜2時間カウンターに置いて、バイアルの内部から結露を蒸発させます(成虫のハエは凝縮液に付着して溺死します)。 11.バイアル用プラグを作る 清潔なバイアルを発泡スチロールの50 mL試験管ホルダーに入れます(チューブを無理に押し込んでまっすぐに立ちます)。正方形のチーズクロス(厚さ2〜4層)を切り取り、バイアルの上に置きます。 以前に作ったプラグのチーズクロスの切れ端をチーズクロスの上に置き、より厚い層を作成します。チーズクロスの上に綿を置き、バイアルに押し込み、バイアルの上部インチほどをしっかりと満たすようにします。 チーズクロスの端の上部を一緒に持ち、ひもで結びます。余分なひもと余分なチーズクロスをカットします(ひもを結んだままにするのに十分な尾と、プラグを快適につかむのに十分なチーズクロスを残します)。注意: プラグがぴったりとフィットするように取り付けます。片手で持ちながら、人差し指と人差し指で引き抜くことができるはずです。バイアルをプラグでつまんで抜けた場合は、緩すぎます。引き抜いたときにポンと音がする場合は、きつすぎる可能性があります。きつすぎる場合、またはプラグに硬くて乾燥した寒天の層がある場合、ハエは窒息する可能性があります。プラグが少し緩すぎるか、バイアルの側面を滑り落ちる場合は、カウンタートップで軽くたたいて、少し幅の広いサイズに押しつぶすことができます。 12.典型的な毎週のスケジュール(効率を最大限に高めるには、リストされている順序でタスクを実行します) 月曜日 (~30分)幼虫をバイアルに供給します。 寒天をプラグ付きの滅菌清潔なバイアルに注ぎます。 水曜日 (~2 h)死んだ大人のバイアルをオーブンに1時間入れ、洗濯のために保管します。 幼虫「赤ちゃんハッチ」を確認してください。 幼虫をバイアルに供給します。 毎週の交配クロスを実行します。 必要に応じてその他の職務:必要に応じて予備供給を持つためのプラグ付きのオートクレーブ洗浄バイアル。必要に応じて新しい食べ物を作り、オートクレーブストローを作ります。必要に応じてオートクレーブジャーを食品やわらに使用してください。 金曜日 (~30分)幼虫「赤ちゃんハッチ」を確認してください。 幼虫をバイアルに供給します。