Laborerhaltung der Unterdipteranen Fliege Bradysia (Sciara) coprophila: Ein neuer/alter aufstrebender Modellorganismus

Die hier beschriebenen Protokolle repräsentieren ein Jahrhundert Erfahrung aus den Lagerzentren von Bradysia (Sciara), die nacheinander von Charles Metz, Helen Crouse und Susan Gerbi beaufsichtigt wurden, sowie Beiträge von anderen. 1. Kreuzungen paaren Verwenden Sie ein erwachsenes Weibchen und zwei erwachsene Männchen pro Glasfläschchen mit einem Durchmesser von 28 mm. Sobald ein 100%iger Erfolg bei der Erkennung von Flügelphänotypen bei Müttern erreicht ist, die nur Töchter oder Söhne haben, verwenden Sie zwei Weibchen und zwei Männchen pro Fläschchen, um die Anzahl der Larven/Fläschchen zu erhöhen. Geben Sie weibliche Exemplare in jedes Fläschchen, bevor Sie die männlichen Ständchen hinzufügen, die schneller aus der Narkose aufwachen als die weiblichen.HINWEIS: In der folgenden Beschreibung wird davon ausgegangen, dass Sie CO2 haben. Alternativ kann Äther verwendet werden, um die erwachsenen Fliegen zu betäuben. Wenn Sie Äther verwenden, um die erwachsenen Fliegen zu betäuben, kleben Sie ein Pad mit gefalteten Labortüchern (z. B. Kimwipes) auf die Innenseite eines runden Glasdeckels eines Coplin-Glases und verwenden Sie eine Pipette, um etwas Äther aus der Flasche zu übertragen, um das Laborwischpad zu befeuchten (aber nicht gesättigt und so nass, dass Ätherflüssigkeit davon abfällt und die Gefahr besteht, dass die Fliegen ertrinken). Legen Sie für Schritt 1.6 unten das angefeuchtete Ätherkissen für ~1 min auf das geöffnete Fläschchen, bis sich die Erwachsenen nicht mehr bewegen. Sobald die erwachsenen Tiere auf eine weiße Keramikplatte gebracht wurden (die anstelle des weißen Fliegenkissens verwendet wird), halten Sie das frisch mit Äther angefeuchtete Pad regelmäßig (wenn die Beine der Fliegen zu zucken beginnen) über die Fliegen auf der Platte für ~1 Minute (ohne sie zu berühren).ACHTUNG: Äther ist brennbar und sollte in einer Dunstabzugshaube und nicht im Kühlschrank gelagert werden. Ordnen Sie in Reichweite ein Tablett mit Fläschchen mit adulten weiblichen Sorten, ein Tablett mit adulten männlichen Tieren und ein Tablett mit leeren Fläschchen mit 2,2 % (wt/vol) Agar an. Platzieren Sie auf dem Labortisch Plakate mit der Aufschrift “weiblich” oder “männlich” und dem Flügelphänotyp der Mutter, so dass das Fläschchen mit den für die Kreuzung ausgewählten adulten Fläschchen in die richtige Gruppe eingeteilt wird, wobei alle Fläschchen in einer Gruppe nur männliche Nachkommen und alle Fläschchen in der anderen Gruppe nur weibliche Nachkommen enthalten.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine Kondenswassertröpfchen in der Durchstechflasche befinden, da die Erwachsenen an den Tröpfchen haften bleiben. Wenn die Fläschchen in einer Plastikbox gelagert wurden, stellen Sie die Fläschchen vor dem Gebrauch mindestens 1 h bei Raumtemperatur auf einen Labortisch, damit das Kondenswasser verdunsten kann. Schalten Sie das CO2 – Gas und die Lampe für das Präpariermikroskop ein.HINWEIS: Eine Lichtquelle mit Lichtleiter wird bevorzugt, da sie weniger Wärme abgibt, wodurch die betäubten Fliegen schneller aufwachen. Klopfen Sie mit Erwachsenen kräftig auf ein Gummipolster auf die Durchstechflasche, so dass die Erwachsenen auf den Boden der Durchstechflasche fallen und den Stopfen entfernen. Setzen Sie die CO2 -Pistolendüse ein und setzen Sie den Stopfen wieder ein. Drücken Sie den Düsenauslöser, so dass CO2 für ~1 min in das Fläschchen fließt, um die Erwachsenen zu betäuben. Stellen Sie einen Fuß auf das Fußpedal, so dass CO2 auf das weiße Flypad und nicht auf die Pistolendüse fließt. Halten Sie das Fußpedal die ganze Zeit gedrückt, wenn sich die Fliegen auf dem weißen Fliegenpad befinden (oder drücken Sie das Fußpedal zeitweise durch, wenn die Beine der Fliegen zu zucken beginnen). Entfernen Sie die Düse und den Stopfen vom Fläschchen und drehen Sie das Fläschchen über ein weißes Fliegenkissen unter einem Präpariermikroskop. Klopfen Sie mit dem Boden des umgedrehten Fläschchens gegen das Mikroskop, so dass die Erwachsenen aus dem Fläschchen auf das weiße Fliegenkissen fallen. Wählen Sie die dicksten adulten Tiere aus (kürzlich mit weißem Hinterleib umschlossen) und nehmen Sie den Erwachsenen mit einer feinen Pinzette vorsichtig am Mittel- oder Hinterbein hoch. Verletzen Sie nicht die Vorderbeine, die für den Paarungstanz verwendet werden. Verwenden Sie keine erwachsenen Tiere, die sich gerade geschlossen haben und deren Körper vollständig weiß und noch nicht schwarz geworden ist, da ihre Flügel kurz und noch nicht vollständig entwickelt sind, so dass der Flügelphänotyp nicht bewertet werden kann. Erwachsene mit schlankerem Bauch können weiterhin verwendet werden, obwohl sie eine verminderte Fruchtbarkeit haben. Verwenden Sie keine dünnen Erwachsenen, deren Flügel senkrecht vom Körper weg erhoben sind, da sie tot sind. Entfernen Sie mit der anderen Hand den Stopfen aus dem Fläschchen mit 2,2 % (Gew./Vol) Agar. Klopfen Sie mit der Hand, die die Pinzette mit dem Erwachsenen hält, kräftig gegen die obere Innenwand des Fläschchens, so dass der Erwachsene auf den Boden des Fläschchens fällt. Setzen Sie den Stopfen wieder in die Durchstechflasche ein. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.11 oben, um jedes Fläschchen mit weiblichen Erwachsenen aufzustellen. Verwende einen Pinsel, um die unbenutzten Fliegen vom weißen Fliegenkissen zurück in ihr Mutterfläschchen zu fegen. Setzen Sie ein Häkchen auf das Etikett der Durchstechflasche, um anzuzeigen, dass sie zum Zusammenstecken verwendet wurde (obwohl sie bei Bedarf erneut verwendet werden kann). Für die routinemäßige Bestandspflege stellen Sie 6-8 Durchstechflaschen mit weiblichen Erzeugern und 6-8 Durchstechflaschen mit männlichen Erzeugermüttern auf (Abbildung 4). Richten Sie die Hälfte der Fläschchen mit Müttern (oder Vätern) aus einer Durchstechflasche für Erwachsene und die andere Hälfte der neuen Fläschchen mit einer anderen Durchstechflasche für Erwachsene ein, um genetische Engpässe zu minimieren.Gelegentlich führt eine Fehltrennung zu einem außergewöhnlichen Männchen in weiblich produzierenden Fläschchen. Wenn ein Fläschchen mit erwachsenen Weibchen ein außergewöhnliches Männchen enthält, entfernen Sie es und zerquetschen Sie, um dieses Männchen zu töten. Wenn möglich, entsorgen Sie alle weiblichen Tiere aus dieser Durchstechflasche und warten Sie einige Tage, bis sich mehr erwachsene Weibchen schließen und sicher für Kreuzungen verwendet werden können.HINWEIS: Es ist vorzuziehen, die Weibchen in diesem Fläschchen nicht für Kreuzungen zu verwenden, da sie sich möglicherweise mit dem außergewöhnlichen Männchen gepaart haben und keine fruchtbare Kreuzung hervorbringen. Nachdem die adulten Weibchen in alle Durchstechflaschen gegeben wurden, wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.11, um zwei adulte Männchen (Abbildung 4) zu jeder Durchstechflasche hinzuzufügen, die bereits weibliche Fliegen enthält. Klopfen Sie das Fläschchen mit den Weibchen auf eine Gummiauflage, damit sie nicht entweichen, wenn die beiden Männchen nacheinander hinzugefügt werden.HINWEIS: Arbeiten Sie schnell und betäuben Sie die erwachsenen Fliegen nicht, da sie sonst getötet werden. Füge auf jedem Fläschchen ein Etikett hinzu, auf dem der Bestand, die Kreuzung (für weibliche oder männliche Nachkommen), ob die Mutter aus dem adulten Fläschchen #1 oder #2 stammt, und das Datum der Paarung angegeben sind. Geben Sie die oben genannten Informationen ebenfalls in ein Notizbuch ein und geben Sie die Anzahl der für jedes Kreuz eingerichteten Fläschchen an.HINWEIS: Es ist praktisch, ein Papiertuch hinzuzufügen, um die männlich produzierenden Fläschchen von den weiblich produzierenden Fläschchen in der Schale zu trennen. Lassen Sie die Fläschchen ~15 Minuten lang ungestört auf der Arbeitsplatte, um sicherzustellen, dass die Erwachsenen aufwachen und herumfliegen. Beobachten Sie, ob sie sich paaren (sehr bald nach dem Aufwachen), bei der das Weibchen und das Männchen von hinten nach hinten ausgerichtet sind (der männliche Clasper greift nach dem spitzen Ovipositor des Weibchens) (Abbildung 4, unten).HINWEIS: Ein erwachsenes Weibchen akzeptiert ein erwachsenes Männchen nur einmal, also stoßen Sie nach der Paarung nicht an die Fläschchen, da dies das Männchen während der Paarung vom Weibchen trennen könnte und das Weibchen sich nicht erneut paart. Stellen Sie das Tablett mit den zusammengesteckten Fläschchen in den Inkubator (z. B. 21 °C). Beschriften Sie das Fach mit dem Namen des Materials (z. B. HoLo2) und der Woche des 5-Wochen-Zyklus (Wochen 1, 2, 3, 4 oder 5).HINWEIS: Bewahren Sie das Tablett mit den frisch verpaarten Fliegen in einem separaten Teil des Inkubators oder einem anderen Inkubator auf, um Sie daran zu erinnern, die Fläschchen nicht zu füttern, bis die Larven geschlüpft sind (siehe unten). 2. Massenverpaarung HINWEIS: In der Regel hat eine alleinstehende B. coprophila-Mutter 60 Nachkommen in ihrer Brut. Wenn eine größere Anzahl von Nachkommen für Experimente benötigt wird, kann eine Massenverpaarung anstelle der oben beschriebenen Einzelpaarverpaarung durchgeführt werden. Die Massenpaarung kann in den Standard-Glasfläschchen mit einem Durchmesser von 28 cm durchgeführt werden, wenn die Mütter einen Tag später für die induzierte Eiablage und Embryonenentnahme entnommen werden. Wird jedoch eine größere Anzahl von Larven benötigt, erfolgt die Massenpaarung in einem Glas mit größerer Oberfläche, um eine Überfüllung zu vermeiden. Stechen Sie mehrere kleine Löcher in den Deckel des Glases, damit die Larven etwas Luft zum Atmen bekommen. Befolgen Sie die Schritte oben in Abschnitt 1, aber verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um alle weiblichen Mütter (oder alle männlichen Mütter) in eine vordere Ecke des weißen Fliegenkissens zu bewegen. Verwenden Sie 10-15 betäubte fette erwachsene Weibchen und fegen Sie diese Gruppe mit einem Pinsel in das Fläschchen oder Glas mit kleinen Löchern im Deckel.HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 aus. schnell für eine Massenpaarung, um eine Übernarkose zu vermeiden, die fruchtbare Kreuzungen verhindern würde. Wählen Sie 20-25 betäubte, fette erwachsene Männchen aus und bewegen Sie sie mit einer feinen Pinzette in die vordere Ecke des weißen Fliegenkissens. Klopfen Sie das Fläschchen oder das Glas mit den Weibchen kräftig auf ein Gummipolster, damit sie nicht entweichen, wenn der Stöpsel oder Deckel entfernt wird, um die betäubte Gruppe erwachsener Männchen mit einem Pinsel von dem weißen Fliegenkissen einzuholen. 3. Embryonenentnahme nach Massenpaarung Einen Tag (24 h) nach der Paarung führen Sie die Schritte 1.5-1.11 durch, um die adulten Fliegen (Mischung aus Weibchen und Männchen) zu betäuben und auf ein weißes Fliegenpad zu übertragen.HINWEIS: Die Oogenese ist noch nicht abgeschlossen, wenn sich die adulten Fliegen paaren, was die abschließende Meiose auslöst; Die reifen Eizellen werden durch Spermien befruchtet, die in der Spermatheca gespeichert sind, wenn die Eizellen entladen werden 29. Der Abschluss der Oogenese kann 1-2 Tage dauern, weshalb nach der Paarung 1 Tag vergehen darf, bevor die Eiablage eingeleitet wird. Nehmen Sie ein erwachsenes Weibchen mit einer Pinzette mit feiner Spitze an den Flügeln und legen Sie es auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm, die 2,2 % (wt/vol) Agar enthält, wobei die Flügel in den Agar eingeführt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt nacheinander für jedes erwachsene Weibchen auf dem weißen Fliegenpad. Die erwachsenen Männchen auf das Fliegenpad legen. Sobald alle weiblichen Fliegen auf dem Agar aufgespießt sind, leiten Sie die Eiablage ein, indem Sie den Kopf vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken, bis die weibliche Fliege anfallsähnliche Bewegungen zeigt. Alternativ kannst du auch sanft ihren Brustkorb zusammendrücken. Sie legt dann innerhalb von 30-60 Minuten eine Traube befruchteter Eier. Decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab, der mit einem wasserfeuchten Labortuch angefeuchtet ist, um eine elektrostatische Anziehung der Eier auf den Deckel zu verhindern. 4. Kontrolle des “Schlupfes” der Larven Überprüfen Sie, ob die Larven 1 Woche nach der Paarung “geschlüpft” sind. Entfernen Sie den Stopfen aus dem Fläschchen und verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um nach Larven zu suchen. Ihr schwarzer Kiefer öffnet und schließt sich immer wieder und sie bewegen sich langsam vorwärts. Wenn es nur wenige Larven gibt, schreiben Sie “wenige” auf das Etikett des Fläschchens, um Sie daran zu erinnern, das Fläschchen weniger zu füttern. Untersuchen Sie jedes Fläschchen in dem Tray mit dem Kreuz und geben Sie die Anzahl der Fläschchen mit Larven in das Notizbuch in eine Spalte neben der Anzahl der Fläschchen ein, die bei dieser Paarung aufgestellt wurden.HINWEIS: Es entwickeln sich keine tiefgelben Eier. Es ist wahrscheinlich, dass sich weiße Eier entwickeln und 1 Tag bevor die Larven schlüpfen, entwickelt sich am vorderen Ende des Eies schwarzes Pigment (der zukünftige Kiefer). Verwechseln Sie Schimmel nicht mit einem weißen Filament, das an seinem Ende in einer schwarzen Kugel endet, mit Larven – der Schimmel bewegt sich nicht, im Gegensatz zu den Larven, die auf dem Agar nach vorne kriechen. Geben Sie ein kleines Stück Stroh (nur einmal) in jedes Fläschchen mit den Larven, um die überschüssige Feuchtigkeit zu kontrollieren und den Larven ein Versteck zu bieten. Stellen Sie das Tablett in den Inkubator (z. B. 21 °C) mit den Larven aus den Paarungskreuzungen der letzten Wochen und beginnen Sie, die Fläschchen mit neu geschlüpften Larven zu füttern (siehe Abschnitt zur Fütterung unten).HINWEIS: In der Regel befinden sich die Larven in einer Gruppe in der Nähe ihrer toten Mutter und beginnen, sie zu fressen; Vermutlich überträgt sich dadurch die Hefe aus dem Darm der Mutter in den Darm der Larven. Sie können am Tag des Schlüpfens der Larven oder innerhalb von 2 Tagen danach mit der Fütterung beginnen. ACHTUNG: Wenn die Fütterung verzögert wird, fressen sich die Larven gegenseitig, so dass nur noch eine fette Larve pro Fläschchen übrig bleibt! Kontrollieren Sie weiterhin Fläschchen, die noch keine Larven enthielten, an 3 Tagen pro Woche. Wenn nach 7-10 Tagen keine Larven geschlüpft sind, entsorgen Sie das Fläschchen oder lagern Sie es zum Waschen des Fläschchens. 5. Zubereitung des Essens HINWEIS: Alle Lebensmittelzutaten sollten frei von Pestiziden sein! Messen Sie mit einem Esslöffel die folgenden Zutaten nach Volumen ab und geben Sie sie in eine Metall- oder Glaspfanne (z. B. eine 8 Zoll x 8 Zoll große Metallbackform): 4 Teile Haferstroh (8 EL), 2 Teile Shitake-Pilzpulver (4 EL), 1 Teil Spinatpulver (2 EL), 1 Teil Brennnesselpulver (2 EL). Mit dem Esslöffel die Zutaten in der Pfanne gut vermischen.HINWEIS: Alternativ können 2 Teile nur Spinatpulver oder nur Brennnesselpulver anstelle von jeweils 1 Teil verwendet werden. Decken Sie die Pfanne mit Alufolie ab und autoklavieren Sie sie im Trockengang für 20-30 Minuten. Lassen Sie es über Nacht oder länger auf Zimmertemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Folie von der Pfanne und brechen Sie die verkrustete sterilisierte Lebensmittelmischung auf, indem Sie mit dem Esslöffel eine pulverförmige Mischung herstellen. 1 Teil (2 gehäufte EL) Bierhefe dazugeben und gut unter die autoklavierte Lebensmittelmischung mischen.HINWEIS: Die Bierhefe wird nicht autoklaviert, da dies die Hefe abtöten würde. Füllen Sie die Lebensmittelmischung in ein steriles Gefäß mit Deckel.HINWEIS: Es kann derselbe Typ von 240-ml-Glas verwendet werden, der für die Massenpaarung verwendet wird, und das obige Rezept füllt das Glas. In ähnlicher Weise sollte die gleiche Art von sterilisiertem Deckelglas nur mit Stroh gefüllt werden, das in einer mit Folie bedeckten Pfanne autoklaviert wurde. 6. Füttern HINWEIS: Passen Sie die Futtermenge entsprechend dem Alter und der Anzahl der Larven an. Geben Sie viel Futter in Gläser mit vielen Larven aus einer Massenpaarung. Geben Sie nur eine leichte Prise Futter auf Petriplatten mit Larven, die einige Tage lang für die Entwicklungsstadien gelagert werden. Die unten beschriebene Fütterungsmethode wurde im Labor von Charles Metz 29 entwickelt und wird von seinem Labor und von Helen Crouse, Susan Gerbi und anderen seit einem Jahrhundert erfolgreich angewendet. Waschen Sie sich die Hände und spülen Sie sie gut aus, um Seife zu entfernen.HINWEIS: Handschuhe werden nicht empfohlen, da sie das Gefühl Ihrer Finger bei der Regulierung der Futtermenge, die jeder Durchstechflasche verabreicht wird, beeinträchtigen. Lagern Sie ein steriles Gefäß mit Deckel mit gemahlenem Stroh und ein steriles Gefäß mit Futter im Inkubator (z. B. 21 °C), in dem die Larven aufbewahrt werden. Nehmen Sie den Deckel vom Glas ab und gießen Sie etwas Essen in eine saubere Schüssel (z. B. eine Süßigkeitendose), um den Zugriff zu erleichtern. Setzen Sie den Deckel des Glases mit den restlichen Lebensmitteln wieder auf. Bewahren Sie die offene Schüssel mit den Lebensmitteln in einem kleinen Tablett aus Metall oder Glas auf. Dadurch wird verhindert, dass Milben oder andere Insekten über die Wand des Tabletts kriechen, um in die Schüssel mit dem Futter zu gelangen. Nimm etwas Nahrung zwischen dem zweiten und dritten Finger (oder zwischen Daumen und zweitem Finger) auf. Nehmen Sie mit der anderen Hand ein Fläschchen aus dem Tablett und entfernen Sie den Stopfen, indem Sie ihn während des Fütterns mit den Fingern festhalten. Untersuchen Sie das Fläschchen auf das Alter und die Anzahl der Larven und geben Sie die entsprechende Menge Futter in das Fläschchen, indem Sie die beiden Finger, die das Futter gegeneinander halten, drehen. Fläschchen mit frisch geschlüpften Larven benötigen nur ein paar Körner Futter. Fläschchen mit älteren Larven sollten eine dünne Schicht Futter haben, die die Oberseite des Agars bedeckt. Wenn sich weißer Schimmel im Fläschchen befindet, verwenden Sie 70%iges Ethanol, das auf ein Labortuch gesprüht wurde, um eine lange Metallsonde (z. B. mit einem Holzgriff) zu reinigen, entfernen Sie den Stopfen und führen Sie die saubere Sonde in das Fläschchen ein, um den Schimmel auf der Oberfläche des Agars abzuklopfen. Wenn viel Schimmel vorhanden ist, schwenken Sie die Sonde, um die Form um die Sonde zu wickeln und sie aus dem Fläschchen zu entfernen. Stören Sie nicht die Oberseite des Agars, da dort Larven leben; Geben Sie nur eine kleine Menge Futter hinzu und setzen Sie den Stecker wieder in die Durchstechflasche ein. Wischen Sie die Sonde mit einem mit 70 % Ethanol angefeuchteten Labortuch sauber, bevor Sie die Sonde aufbewahren oder zur Reinigung eines anderen Fläschchens verwenden. Sobald alle Fläschchen in einer Schale gefüttert wurden, setzen Sie die Schale wieder in den Inkubator ein und entfernen Sie die nächste Schale für die Fütterung wie in Schritt 6.3. Gießen Sie nach Beendigung der Fütterung das restliche Futter aus der Schüssel in das zuvor sterilisierte Glas, verschließen Sie das Glas und bewahren Sie es im Inkubator auf. 7. Sammlung von Larven oder Puppen auf Petriplatten Bei einer kleinen Anzahl von Larven verwenden Sie eine Metallsonde oder einen Spatel, der mit 70 % Ethanol abgewischt wurde, um in die oberste Agarschicht in einem Fläschchen zu graben und den anhaftenden Agar mit einigen Larven in eine sterile Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm zu überführen, die zur Hälfte mit 2,2 % (Gew./Vol.) Agar gefüllt ist. Bei einer größeren Anzahl von Larven führen Sie einen Spatel entlang der Wand am Boden des Fläschchens ein, um den Agar-Pfropfen aus dem Fläschchen zu lösen, und legen Sie ihn mit der Vorderseite nach oben in eine leere Petrischale. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Larven an der Spitze des Agarpfropfens zu finden, und übertragen Sie sie mit einer feinen Pinzette in eine sterile Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm, die zur Hälfte mit 2,2 % (Gew./Vol.) Agar gefüllt ist. Mit einem Präpariermikroskop sortieren Sie die Larven mit einer feinen Pinzette in Gruppen des gleichen Entwicklungsstadiums.HINWEIS: Aufgrund einer leichten Entwicklungsasynchronität gibt es auf der Petriplatte mehrere verschiedene Cluster von sortierten Larven mit 2,2 % (wt/vol) Agar. Fügen Sie eine kleine Prise Futter hinzu und stellen Sie die Petrischale mit den Larven in den Inkubator. Nehmen Sie es täglich zur Beobachtung mit dem Präpariermikroskop ab, um das gewünschte Entwicklungsstadium auszuwählen.HINWEIS: Bei DNA-Puff-Studien durchlaufen frühe Augenfleckenlarven die Stadien 10×5, 12×6, 14×7 und das Randaugen-/Fallkieferstadium mit ~1 Tag in jedem dieser Stadien 30,31. Wählen Sie Puppen, deren Augen zu 1/4 bis 1/2 mit Pigment gefüllt sind, um die Meiose-Stadien I und II in den Puppenhoden zu haben. 8. Kühlraumlagerung von Larven Bewahren Sie als Backup etwa vier Fläschchen mit weiblichen Larven und vier Fläschchen mit männlichen Larven aus 2 aufeinanderfolgenden Kreuzungswochen im Kühlraum auf. Füttern Sie für die Backup-Lagerung Larven, die sich im frühen 4. Stadium ( Pre-Eyespot-Stadium) befinden, und legen Sie sie in ein offenes Tablett auf einem Regal im Kühlraum. Füttern Sie diese Fläschchen nur einmal im Monat. Entfernen Sie die 16 Fläschchen aus den 2 aufeinanderfolgenden Wochen der Kreuzungen aus der Kälte nach 2-3 Monaten (markieren Sie dies als Erinnerung in einem Kalender); Stellen Sie sie in einen Brutkasten (z. B. 21 °C), um sie normal zu füttern, und lassen Sie sie sich zu erwachsenen Tieren entwickeln, die Sie für Kreuzungen verwenden können. Wenn die Fläschchen aus dem Kühlraum genommen werden, stellen Sie einen frischen Satz Fläschchen mit Larven im frühen 4. Stadium in den Kühlraum, damit diese Fläschchen immer als Backup für Vorräte zur Verfügung stehen.HINWEIS: Die Lebensfähigkeit nach der Lagerung in Kühlräumen wurde nicht systematisch für verschiedene Entwicklungsstadien getestet, aber unsere Erfahrung zeigt, dass die Kühllagerung von Larven im frühen 4. Stadium gut funktioniert. 9. Waschen der Fläschchen Nachdem die erwachsenen Tiere gestorben sind (~2-3 Wochen nach der Eklosion), nehmen Sie die Fläschchen aus dem Inkubator und stellen Sie sie 1 Stunde lang bei 60-70 °C auf, um alle verbleibenden Organismen abzutöten. Entferne die Wattestäpsel und bewahre sie in einer Plastikbox auf. Kratzen Sie den Agar-Stopfen mit einem Spatel aus dem Fläschchen in einen Abfalleimer. Weichen Sie die Fläschchen über Nacht oder länger in Wasser in einer Schüssel ein. Verwenden Sie eine eigens für diesen Zweck aufbewahrte Reagenzglasbürste (niemals für Gefäße mit Chemikalien oder Seife verwendet) und schrubben Sie in der Durchstechflasche unter fließendem Leitungswasser auf und ab. Legen Sie die gereinigte Durchstechflasche mit der offenen Seite nach unten in einen Metallkorb. Füllen Sie den Korb mit gereinigten Fläschchen.HINWEIS: Verwenden Sie niemals Seife in den Durchstechflaschen, da Seifenreste B. coprophila abtöten könnten. Setzen Sie einen Drahtgitterdeckel in den Korb und drehen Sie den Korb um, während Sie den Deckel an Ort und Stelle halten, um alle Fläschchen mit entionisiertem Wasser zu füllen. Halten Sie den Deckel fest und drehen Sie den Korb um, um das entionisierte Wasser aus den Fläschchen zu entleeren. Wiederholen Sie die Spülungen mit entionisiertem Wasser 4x. Stellen Sie die Körbe mit den gereinigten Fläschchen auf Papiertücher oder eine offene Netzplattform (z. B. Laborwagen), um sie über Nacht oder länger zu trocknen. Bewahren Sie die trockenen Fläschchen in einer Schublade auf.HINWEIS: Lassen Sie Fläschchen mit toten Erwachsenen nicht zu lange stehen, bevor Sie sie waschen, da dies zu einem Milbenbefall führen kann. 10. Agar gießen Füllen Sie einen großen Behälter (Metallkorb oder Metalltablett) mit sauberen Fläschchen und fügen Sie jedem Fläschchen einen Wattestäbchen hinzu. Verwenden Sie die Stopfen, die beim Waschen der Fläschchen aus alten Fläschchen entnommen wurden, wieder und verwenden Sie die Stopfen wiederholt, bis sie sich zersetzen und auseinanderfallen und entsorgt werden sollten. Sterilisieren Sie den Behälter mit den verstopften Fläschchen in einem Trockenzyklus für ~30 Minuten und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen, um sie im Autoklavbehälter aufzubewahren. Halten Sie immer zwei Behälter (einen aktiv genutzten und einen Ersatzbehälter) mit autoklavierten, verstopften Fläschchen bereit. Geben Sie 11,0 g Agarpulver in einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben und fügen Sie 500 ml destilliertes Wasser hinzu, um eine 2,2%ige (Gew./Vol.) Agarlösung herzustellen, die ausreicht, um ~24 Fläschchen (~21 ml/Fläschchen) zu gießen. Schwenken Sie den Kolben und stellen Sie ihn in die Mikrowelle.HINWEIS: Verwenden Sie von hier an einen hitzebeständigen Autoklavenhandschuh, um den Kolben zu handhaben. Die gleiche 2,2%ige Agarlösung kann bei Bedarf in Petriplatten (für gepflückte Larven) oder Gläser (für Massenpaarungen) gegossen werden. 1 Minute in der Mikrowelle erhitzen, den Kolben herausnehmen, um ihn zu schwenken, ihn wieder in die Mikrowelle stellen und erneut 1 Minute in der Mikrowelle erhitzen. Wiederholen Sie dies mehrmals. Beobachten Sie die Flasche durch die Glastür des Mikrowellenherds. Wenn die Agarlösung zu schäumen und zu kochen beginnt, betätigen Sie sofort den manuellen Stoppknopf. Schwenken Sie den Kolben zu diesem Zeitpunkt nicht (er könnte überkochen), sondern nehmen Sie ihn vorsichtig vom Ofen auf die Arbeitsfläche und lassen Sie ihn einige Minuten ruhen. Entfernen Sie den Stopfen von einem sterilisierten Fläschchen und halten Sie ihn mit einer Hand fest. Gießen Sie mit der anderen Hand ~2,5 cm hohes 2,2% Agar in das sterilisierte Fläschchen. Setzen Sie dann den Stopfen wieder in die Durchstechflasche ein. Wiederholen Sie dies, bis das gesamte Agar gegossen wurde.HINWEIS: Wenn zu wenig Agar in das Fläschchen gegossen wird, trocknet es während des Gebrauchs schneller aus und schrumpft von den Wänden des Fläschchens ab. Wenn zu viel Agar in das Fläschchen gegossen wird, ist es schwierig, sich auf die oberste Schicht zu konzentrieren, wenn die “Baby-Luke” der Larven mit einem Präpariermikroskop bewertet wird. Lassen Sie die ausgegossenen Fläschchen 1-2 Tage bei Raumtemperatur auf der Theke stehen, damit der Agar aushärtet und die Feuchtigkeit vollständig verdunstet. Verwenden Sie die Fläschchen zum Anpaaren von Kreuzen oder lagern Sie sie auf der Seite liegend in einer Kunststoffbox mit dicht schließendem Deckel; Lege ein mit Wasser angefeuchtetes Papiertuch auf die Fläschchen, bevor du den Deckel auf die Schachtel legst (dies verhindert, dass der Agar austrocknet und von der Wand des Fläschchens wegschrumpft). Lagern Sie die Box mit gegossenen Fläschchen einige Tage bei Raumtemperatur oder bis zu 2 Wochen im Kühlschrank oder Kühlraum bei 4 °C. Bevor Sie die gelagerten Fläschchen verwenden, nehmen Sie sie aus der Schachtel und lassen Sie sie ein oder zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Theke stehen, damit das Kondenswasser aus dem Inneren der Fläschchen verdunsten kann (die erwachsenen Fliegen würden am Kondensat haften bleiben und ertrinken). 11. Herstellung von Stopfen für Fläschchen Legen Sie ein sauberes Fläschchen in einen 50-ml-Reagenzglashalter aus Styropor (drücken Sie das Röhrchen hinein, sodass es gerade steht). Schneiden Sie ein Stück Käsetuch (2-4 Schichten dick) aus und legen Sie es auf das Fläschchen. Lege Reste von zuvor hergestellten Steckern auf das Käsetuch, um eine dickere Schicht zu erzeugen. Lege Baumwolle auf das Käsetuch und drücke es nach unten in das Fläschchen, wobei du darauf achtest, dass du den oberen Zentimeter des Fläschchens fest ausfüllst. Halte die Oberseite der Enden des Käsetuchs zusammen und binde es mit einer Schnur zusammen. Schneiden Sie die überschüssige Schnur und das überschüssige Käsetuch ab (lassen Sie genügend Schwänze der Schnur, um sie festzubinden, und genügend Käsetuch, um den Stecker bequem zu greifen).HINWEIS: Stecken Sie die Stecker so ein, dass sie fest sitzen. Du solltest sie mit Zeige- und Zeigefinger herausziehen können, während du sie in einer Hand hältst. Wenn Sie das Fläschchen am Stopfen aufheben und es herausfällt, ist es zu locker. Wenn es beim Herausziehen ein lautes Knallgeräusch macht, kann es sein, dass es zu eng ist. Wenn er zu fest ist oder wenn der Pfropfen eine Schicht aus hartem, trockenem Agar aufweist, können die Fliegen ersticken. Wenn der Stopfen etwas zu locker ist oder an den Seiten des Fläschchens herunterrutscht, kann er auf die Arbeitsplatte geklopft werden, um ihn in eine etwas breitere Größe zu drücken. 12. Typischer Wochenplan (für maximale Effizienz Aufgaben in der aufgeführten Reihenfolge ausführen) Montag (~30 min)Fläschchen mit Larven füttern. Gießen Sie Agar in sterile, saubere Fläschchen mit Stopfen. Mittwoch (~2 h)Fläschchen mit toten Erwachsenen für 1 h in einen Ofen stellen und zum Waschen aufbewahren. Prüfen Sie, ob Larven “Baby-Hatch” haben. Fläschchen mit Larven füttern. Führen Sie wöchentliche Paarungen durch. Weitere Aufgaben nach Bedarf: Autoklavieren Sie saubere Fläschchen mit Stopfen, um bei Bedarf einen Reservevorrat zu haben; Stellen Sie neue Lebensmittel her und autoklavieren Sie Stroh nach Bedarf; Autoklavieren Sie Gläser nach Bedarf für Lebensmittel und Stroh. Freitag (~30 min)Prüfen Sie, ob Larven “Baby-Hatch” haben. Fläschchen mit Larven füttern.