Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche
Summary
La colonizzazione dei rizobatteri che promuovono la crescita delle piante (PGPR) nella rizosfera è essenziale per il suo effetto di promozione della crescita. È necessario standardizzare il metodo di rilevamento della colonizzazione batterica della rizosfera. Qui descriviamo un metodo riproducibile per quantificare la colonizzazione batterica sulla superficie della radice.
Abstract
La misurazione della colonizzazione batterica sulla radice di Arabidopsis thaliana è uno degli esperimenti più frequenti negli studi di interazione pianta-microbi. Un metodo standardizzato per misurare la colonizzazione batterica nella rizosfera è necessario per migliorare la riproducibilità. Abbiamo prima coltivato A.thaliana sterile in condizioni idroponiche e poi abbiamo inoculato le cellule batteriche nella rizosfera a una concentrazione finale di OD600 di 0,01. A 2 giorni dall’inoculazione, il tessuto radicale è stato raccolto e lavato tre volte in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Le radici sono state quindi pesate e le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte a vortice. La sospensione cellulare è stata diluita in un gradiente con un tampone salino tamponato con fosfato (PBS), seguito da una placcatura su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 10 ore, quindi le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per indicare le cellule batteriche colonizzate sulle radici. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la colonizzazione batterica nella rizosfera in condizioni di mono-interazione, con una buona riproducibilità.
Introduction
Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l’intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser 1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ3, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della limitazione di visualizzare solo zone radicali parziali al microscopio, a volte può essere influenzato da pregiudizi soggettivi.
Qui descriviamo un metodo quantitativo, che include la raccolta delle cellule batteriche colonizzate e il conteggio delle CFU batteriche su una piastra. Questo metodo si basa sulla diluizione e sulla placcatura mediante la quale è possibile contare i ceppi colonizzati che sono stati strappati dalle radici delle piante e calcolare il numero totale di batteri colonizzati sulla radice 4,5.
In primo luogo, A. thaliana è stata coltivata in condizioni idroponiche, quindi le cellule batteriche sono state inoculate nella rizosfera a una concentrazione finale di 0,01 OD600. I tessuti radicali infetti sono stati raccolti 2 giorni dopo l’inoculazione e lavati in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Inoltre, le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte, diluite in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e piastrate su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Dopo l’incubazione a 37 °C per 10 ore, le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per determinare le cellule batteriche colonizzate sulle radici.
Questo metodo è altamente applicabile, ha una buona ripetibilità ed è più adatto per un’accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere una buona riproducibilità, ci sono quattro passaggi critici per il processo di rilevamento della colonizzazione di questo protocollo. In primo luogo, è necessario assicurarsi che il numero di cellule batteriche inoculate sia esattamente lo stesso in ogni esperimento. In secondo luogo, è necessario anche controllare l’intensità di pulizia dei batteri non colonizzati con acqua sterile. In terzo luogo, ogni processo di diluizione del campione deve essere agitato prima di essere eseguito per lasciare che il …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (32370135), dal Programma di innovazione dell’Accademia cinese delle scienze agricole (CAAS-CSAL-202302), dal Progetto scientifico e tecnologico del Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
