Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand
Summary
Die Besiedlung mit pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) in der Rhizosphäre ist essentiell für ihre wachstumsfördernde Wirkung. Es ist notwendig, die Methode zum Nachweis der bakteriellen Rhizosphärenbesiedlung zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Wurzeloberfläche.
Abstract
Die Messung der bakteriellen Besiedlung der Arabidopsis thaliana-Wurzel ist eines der häufigsten Experimente in Studien zur Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, ist eine standardisierte Methode zur Messung der bakteriellen Besiedlung in der Rhizosphäre notwendig. Wir kultivierten zunächst steriles A.thaliana unter hydroponischen Bedingungen und inokulierten dann die Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von OD600 von 0,01. 2 Tage nach der Inokulation wurde das Wurzelgewebe entnommen und dreimal in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Wurzeln gewogen und die an der Wurzel besiedelten Bakterienzellen durch einen Wirbel gesammelt. Die Zellsuspension wurde in einem Gradienten mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und anschließend auf ein Luria-Bertani (LB)-Agarmedium aufgebracht. Die Platten wurden 10 h lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die einzelnen Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die Bakterienzellen anzuzeigen, die auf den Wurzeln besiedelt waren. Diese Methode wird verwendet, um bakterielle Besiedlung in der Rhizosphäre unter Monointeraktionsbedingungen mit guter Reproduzierbarkeit nachzuweisen.
Introduction
Es gibt quantitative und qualitative Methoden, um die Rhizosphärenbesiedlung durch einen einzelnen Bakterienstamm nachzuweisen. Für die qualitative Methode sollte ein Stamm verwendet werden, der konstitutiv Fluoreszenz exprimiert, und die Fluoreszenzverteilung und -intensität sollte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokalen Laserinstrumenten untersucht werden 1,2. Diese Strategien können die bakterielle Besiedlung in situ3 gut widerspiegeln, aber sie sind bei der Quantifizierung nicht so genau wie herkömmliche Plattenzählmethoden. Aufgrund der Einschränkung, nur partielle Wurzelzonen unter dem Mikroskop anzuzeigen, kann dies manchmal durch subjektive Verzerrungen beeinflusst werden.
Hier beschreiben wir eine quantitative Methode, die das Sammeln der besiedelten Bakterienzellen und das Zählen der bakteriellen KBE auf einer Platte beinhaltet. Dieses Verfahren basiert auf einer Verdünnung und Plattierung, bei der die besiedelten Stämme, die von den Pflanzenwurzeln abgestreift wurden, gezählt und die Gesamtzahl der besiedelten Bakterien auf der Wurzel berechnet werdenkann 4,5.
Zuerst wurde A. thaliana unter hydroponischen Bedingungen kultiviert, und dann wurden Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von 0,01 OD600 inokuliert. Das infizierte Wurzelgewebe wurde 2 Tage nach der Inokulation entnommen und in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Des Weiteren wurden Bakterienzellen, die an der Wurzel besiedelt waren, gesammelt, in phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und auf ein Luria-Bertani (LB) Agarmedium aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 10 h wurden einzelne Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die auf den Wurzeln besiedelten Bakterienzellen zu bestimmen.
Diese Methode ist sehr gut anwendbar, hat eine gute Wiederholbarkeit und eignet sich besser für die genaue Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Rhizosphäre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um eine gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, gibt es vier kritische Schritte für den Besiedlungsnachweis dieses Protokolls. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Anzahl der geimpften Bakterienzellen in jedem Experiment genau gleich ist. Zweitens ist es auch notwendig, die Reinigungsintensität der unbesiedelten Bakterien mit sterilem Wasser zu kontrollieren. Drittens muss jeder Probenverdünnungsprozess vor der Durchführung vortexiert werden, damit sich die Probe in einem vollständigen Mischzustand befindet,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32370135), dem Innovationsprogramm der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS-CSAL-202302) und dem Wissenschafts- und Technologieprojekt des Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29) finanziert.
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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