Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Aislamiento de componentes (Figura 1 y Figura 2)Antes de utilizar los explantes centrales y las poblaciones celulares en el cocultivo de ensamble, estos componentes deben verificarse bajo el microscopio (Figura 1). Los explantes del núcleo deben tener un diámetro uniforme (100-200 μm) y no tener torceduras ni arrugas visibles. Las células endoteliales deben presentar una forma alargada en contacto con otras células, lo que no ocurre cuando se siembran a una densidad demasiado baja debido a un bajo rendimiento inicial del aislamiento. En este caso, las células endoteliales asumen una forma más redondeada con extensiones citoesqueléticas y proliferan marcadamente más lentamente. Divídelos 1:5 después de 7-10 días. Los fibroblastos tendinosos aislados de los tendones de Aquiles asumen una morfología más redondeada en comparación con sus homólogos humanos en 1-2 pasos (10-14 días cada uno) cuando se dividieron 1:6. Los macrófagos son mucho más pequeños que los fibroblastos o las células endoteliales y no proliferan después del aislamiento. Dependiendo del lote, su forma puede variar de piramidal a redonda. Los fenotipos de los componentes celulares se verificaron con citometría de flujo. Se utilizó un anticuerpo CD31 conjugado como marcador de células endoteliales (Figura 2A). Al establecer el umbral de fluorescencia en función de una muestra de control no teñida (gris), se identificó que el 90,1 % de las células endoteliales del paso 1 (P1) y el 48,7 % del pasaje 2 (P2) eran CD31 positivas. Para caracterizar los fibroblastos tendinosos se utilizó una línea de ratón modificada genéticamente que coexpresa el marcador de fibroblastos tendinosos Scleraxis junto con una proteína verde fluorescente (ScxGFP) y un anticuerpo CD146 conjugado (Figura 2B)35,60. Después de un paso (P1), el 37,3% de los fibroblastos eran ScxGFP+CD146-, el 0,2% ScxGFP+CD146+, el 4,3% ScxGFP-CD146+ y el 58% ScxGFP-CD146-. Después de dos pasadas (P2), el porcentaje de células ScxGFP+CD146- disminuyó al 27,6%, el porcentaje de células ScxGFP+CD146+ aumentó al 6,9%, el porcentaje de células ScxGFP-CD146+ aumentó al 10,6% y el porcentaje de células ScxGFP-CD146- disminuyó al 54,9%. Para identificar y caracterizar los macrófagos, se utilizó un anticuerpo F4/80 en combinación con un anticuerpo CD86 y un anticuerpo CD206 (Figura 2C). Tras el aislamiento y el cultivo, el 96,4% de las células derivadas de la médula ósea fueron positivas para F4/80. Entre estas células positivas para F4/80, el 8,6% eran CD206+CD86-, el 23,6% CD206+CD86+, el 28,3% CD206-CD86+ y el 39,4% CD206-CD86-. La velocidad de reticulación del colágeno puede variar de un lote a otro y debe probarse antes de comenzar los experimentos. Apariencia del ensamblaje (Figura 3)En condiciones de cultivo similares a las de una lesión (36 °C, 20%Ø2), el explante del núcleo permaneció mecánicamente estirable, no cambió de apariencia y continuó siendo visualmente distinguible y físicamente separable del hidrogel circundante durante al menos 21 días (Figura 3A, B). El hidrogel circundante se compactó con el tiempo, y la velocidad de compactación dependió de la población celular sembrada en él. Los fibroblastos derivados del tendón de Aquiles contrajeron el hidrogel circundante más rápidamente y lo hicieron radialmente cuando estaban en un hidrogel moldeado alrededor de un explante central y en todas las direcciones cuando no lo estaban (Figura 3B, C). Inicialmente, los hidrogeles libres de células colocados alrededor de un explante de núcleo también se compactaron. Esta contracción probablemente fue causada por la migración de células desde el explante central, lo que indica una interfaz dinámica entre compartimentos. Como los hidrogeles libres de células sin un explante de núcleo incrustado no se compactaron de manera detectable, la contribución de la contracción inducida por la pérdida de agua parece ser insignificante (Figura 3B y Archivo Suplementario 6). Por lo tanto, la falta de compactación de hidrogel puede utilizarse para detectar errores en el ensamblaje del ensamblaje (es decir, bajas concentraciones de células) y debe verificarse antes de continuar con métodos de lectura más costosos. Al establecer este método, los errores comunes que reducían la concentración celular incluían la muerte de las células en el hidrogel extrínseco porque se dejaban durante demasiado tiempo en la solución de reticulación relativamente dura (pH alto, baja temperatura) y el secado de los explantes del núcleo porque el tiempo entre la aspiración del medio y la inyección del hidrogel era demasiado largo, o porque el explante del núcleo estaba sujetado demasiado alto para incrustarse en el colágeno. Microscopía de fluorescencia confocal: análisis de viabilidad y morfología (Figura 3)Una vez retirados de las pinzas con tijeras (Figura 3B), los ensamblajes se pueden fijar, teñir y obtener imágenes con un microscopio confocal en su conjunto sin necesidad de seccionarlos. Aquí, los ensamblajes de núcleo // célula endotelial, núcleo // macrófago y núcleo // fibroblastos se tiñeron con DAPI (NucBlue) y homodímero de etidio (EthD-1) para analizar la viabilidad y DAPI y F-actina para analizar la morfología y la propagación celular en el hidrogel de colágeno 3D (Figura 3D). Se cuantificó la viabilidad de los ensamblajes de células endoteliales del núcleo (Figura 3E) y se encontró que era generalmente menor después del ensamblaje del ensamblaje de los ensambloides que lo informado previamente para los ensamblajes de núcleos // macrófagos y núcleos // fibroblastos84. Sin embargo, la viabilidad se mantuvo estable durante el cultivo ensamblado hasta al menos el día 7. Microdaño inducido mecánicamente y medición de propiedades mecánicas (Figura 4)Los tornillos y pasadores unidos a los soportes de abrazadera permiten la fijación de conjuntos sujetados a dispositivos de estiramiento uniaxiales. El dispositivo de estiramiento hecho a medida utilizado aquí está equipado con una célula de carga de 10 N y ha sido descrito en publicaciones anteriores (Figura 4A)22. Todas las muestras se acondicionaron previamente con cinco ciclos de estiramiento al 1% de deformación antes de las mediciones. El registro de la curva completa de tensión-deformación de los explantes o ensamblajes de núcleos (Figura 4B) permitiría cuantificar el módulo elástico lineal (α), la tensión máxima (β) y la deformación máxima (у). Sin embargo, también daña irreversiblemente el explante del núcleo o el ensamblaje, lo que hace imposible evaluar el desarrollo longitudinal de la tensión máxima (β) y la deformación máxima (у) para las mismas muestras (Figura 4B). Aquí, el módulo elástico lineal se utilizó como medida de la capacidad de la muestra para soportar fuerzas, ya que esta medición requiere estirar la muestra a solo un 2% de deformación, lo que se ha demostrado previamente que no causa reducciones permanentes en el módulo elástico lineal18. En particular, los ensamblajes de células centrales // endoteliales se expusieron al procedimiento de pinzamiento a una deformación del 2% (aproximadamente el final de la región elástica lineal) o al 6% de deformación (aproximadamente la deformación máxima). El microdaño resultante se evaluó midiendo el módulo elástico lineal antes y después del procedimiento (Figura 4C). De acuerdo con los experimentos realizados previamente con explantes de núcleo monocultivados, los ensamblajes de células endoteliales del núcleo retuvieron su módulo elástico lineal durante al menos 14 días cuando se cultivaron en condiciones de nicho cuasi-homeostático (29 °C, 3%O2) y se expusieron a cepas no superiores al 2,21. Con respecto a la estimulación mecánica basal, el estiramiento estático aplicado a través de las pinzas pareció imitar suficientemente los niveles de deformación nativa experimentados por las unidades del núcleo tendinoso in vivo para prevenir procesos catabólicos generalmente asociados con la descarga de la matriz87. De hecho, la disminución progresiva y estadísticamente significativa del módulo elástico lineal observada en los ensamblajes de células endoteliales del núcleo expuestos a una tensión del 6% podría atribuirse a la descarga de la matriz derivada del microdaño de la matriz inducido mecánicamente. Al realizar estos experimentos, es importante evitar que el conjunto se seque. En este caso, se envolvían en papel esterilizado en autoclave y mojado, pero también podían ser viables otros métodos en función de su compatibilidad con el dispositivo de estiramiento utilizado. Como la fricción entre las abrazaderas metálicas y el explante del núcleo es limitada, agregue pequeños trozos de papel entre el metal y el explante del núcleo durante la sujeción para evitar el deslizamiento y supervise de cerca el proceso de estiramiento para detectar y excluir los explantes y ensamblajes del núcleo deslizados. Análisis del transcriptoma específico del compartimento y del secretoma específico del conjunto (Figura 5 y Figura 6)En el primer conjunto de experimentos de monocultivo del núcleo que se presenta aquí, se evaluó la estabilidad de la expresión génica del núcleo después del aislamiento del explante para desacoplar el aislamiento de los efectos experimentales (Figura 5A). Aunque se necesita un mayor número de réplicas para obtener conclusiones precisas, la expresión de Vegfa y Mmps aumentó fuertemente en los explantes de núcleo recién aislados a las pocas horas del aislamiento del explante cuando se cultivaron en condiciones de nicho similares a lesiones (37 °C, 20% O2). La neovascularización es un sello distintivo central de la enfermedad y la reparación del tendón que podría, en parte, ser impulsada por células endoteliales activadas por factores proangiogénicos (es decir, el factor de crecimiento endotelial vascular, Vegfa) secretado por el núcleo del tendón bajo hipoxia88. Examinando el primer paso de esta posible diafonía (Figura 5B), se encontró que la expresión tanto de Vegfa como del marcador de hipoxia anhidrasa carbónica 9 (Ca9) aumentó de manera estadísticamente significativa en los explantes monocultivados bajo baja tensión de oxígeno (3% O2) en contraste con los monocultivados bajo alta tensión de oxígeno (20% O2). Mientras tanto, la menor tensión de oxígeno no pareció causar cambios en la expresión de marcadores de fibroblastos tendinosos como Scleraxis (Scx) y colágeno-1 (Col1a1). En conjunto, estos resultados identifican a las células residentes en el núcleo como contribuyentes plausibles a la señalización proangiogénica en un nicho hipóxico. A continuación, se evaluó la activación de las células endoteliales por la señalización proangiogénica del núcleo en el cocultivo del núcleo // ensamblaje de células endoteliales bajo alta (20% O2) y baja (3% O2) tensión de oxígeno. Afortunadamente, la composición modular de los ensambles permite el análisis del transcriptoma específico del compartimento después del cultivo al separar físicamente el explante central del hidrogel de colágeno extrínseco (Figura 6A). En el explante del núcleo (Figura 6D), se confirmó de nuevo que la expresión de Vegfa aumentaba bajo baja tensión de oxígeno, aunque el efecto sobre otros marcadores hipóxicos como Fgf2 fue menos claro y requiere un mayor número de réplicas para obtener conclusiones precisas. Además, la expresión de marcadores proinflamatorios como el Tnf-α y los marcadores de degradación de la matriz extracelular como el Mmp3 disminuyeron en el núcleo bajo baja tensión de oxígeno. En el hidrogel extrínseco sembrado inicialmente con células endoteliales (Figura 6E), la presencia de un explante de núcleo vivo (aC) disminuyó la expresión de Vegfa bajo baja tensión de oxígeno, pero no bajo alta tensión de oxígeno. Además, la presencia de un explante de núcleo desvitalizado (dC) bajo baja tensión de oxígeno tampoco disminuyó la expresión de Vegfa . Bajo baja tensión de oxígeno, la expresión de Tnf-α en el hidrogel extrínseco fue comparable alrededor de aC/dC, pero aumentó bajo alta tensión de oxígeno alrededor de los explantes de núcleo vivo. La expresión de Fgf2 disminuyó en todas las condiciones en comparación con el hidrogel extrínseco cargado de células endoteliales cultivado alrededor de un explante de núcleo desvitalizado bajo alta tensión de oxígeno, pero la mayoría bajo baja tensión de oxígeno. La expresión de Mmp3 fue más alta alrededor de los explantes de núcleo vivo bajo alta tensión de oxígeno y más baja alrededor de los explantes de núcleo desvitalizados bajo baja tensión de oxígeno. En general, las células endoteliales cocultivadas parecen responder tanto al explante del núcleo activo, que es capaz de iniciar la diafonía como a las variaciones en los niveles de oxígeno. Un análisis más exhaustivo del transcriptoma facilitaría la elucidación de sus respectivas contribuciones. La modularidad del sistema ensamblado permite la integración de células modificadas genéticamente que contienen genes reporteros fluorescentes. Aquí, las células endoteliales aisladas de ratones Pdgfb-iCreER mG89 se sembraron en el compartimento del hidrogel. Estas células coexpresan la subunidad b del factor de crecimiento derivado de plaquetas (Pdgfb) del marcador de células endoteliales junto con la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), que hace que las células endoteliales que expresan Pdgfb aparezcan verdes bajo la microscopía (Figura 6C). Utilizando este método, se confirmó que la presencia de células endoteliales que expresan Pdgfb se mantuvo durante 7 días en cultivo (37 °C) y pareció ser independiente de la tensión de oxígeno (20%O2 frente a 3%O2). Para analizar el secretoma de los ensambles, el medio de cultivo utilizado respectivamente para el cocultivo de células libres de células y el núcleo // fibroblastos, el núcleo // macrófagos o el cocultivo de células endoteliales centrales // se reemplazó por su contraparte libre de suero tres días antes de aspirar y congelar el sobrenadante ahora enriquecido con el secretoma (Figura 6A). Este tiempo de enriquecimiento fue suficiente para detectar citocinas como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con un ensayo de MSD, como se muestra aquí para explantes de núcleos y ensamblajes de fibroblastos de núcleos // cultivados en condiciones de nicho similares a lesiones (Figura 6B). Las consideraciones importantes al analizar los secretomas y transcriptomas de los explantes y ensambles de núcleos se refieren al uso de controles adecuados. Los explantes de núcleo recién aislados tienen un valor limitado, ya que especialmente su expresión de Vegfa y Mmps aumenta fuertemente a las pocas horas del aislamiento (Figura 5A). Los explantes emparejados en el tiempo rodeados por un hidrogel inicialmente libre de células son más adecuados como controles para la expresión génica del compartimento central. Para el hidrogel extrínseco, los hidrogeles cargados de células cultivados sin un explante de núcleo son controles inferiores en comparación con los hidrogeles cargados de células cultivados alrededor de explantes de núcleo desvitalizados (Archivo Suplementario 7), principalmente porque se compactan en formas redondeadas en lugar de hidrogeles alargados, lo que cambia en gran medida la morfología celular (Figura 3A). Figura 1: Aislamiento de componentes de ensamblaje y ensamblaje para modelar diafonía in vivo . Se extrajeron explantes de núcleos tendinosos de colas de ratón, se cortaron y se sujetaron. Los músculos de las patas de ratón (es decir, el cuádriceps femoral (QF), el gastrocnemio (G) y el tibial anterior (TA)) se digierieron para aislar células endoteliales que luego se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos. Los tendones de Aquiles (AT) también se digierieron para aislar los fibroblastos tendinosos, que luego se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos. La médula ósea de la tibia y el fémur fue expulsada de los huesos. A continuación, los monocitos aislados se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos y se diferenciaron en macrófagos naïf. Las imágenes de microscopía óptica (10x) muestran la apariencia de los explantes centrales, las células endoteliales, los fibroblastos tendinosos y los macrófagos inmediatamente antes de su integración en los ensambles. Durante el ensamblaje, las células cultivadas en plástico se pusieron en suspensión y luego se sembraron en una solución de colágeno-1 (1,6 mg/mL). A continuación, la mezcla de célula e hidrogel se moldeó alrededor del explante del núcleo sujetado y se polimerizó durante 50 min a 37 °C antes de añadir el medio de cultivo. Las condiciones de cultivo se controlaron a través de las pinzas (tensión mecánica) y los ajustes de la incubadora (concentración de oxígeno, temperatura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Caracterización de los componentes del ensamblaje celular. (A) Análisis citométrico de flujo representativo de células endoteliales derivadas del músculo después de un paso (P1, fila superior) y dos pases (P2, fila inferior). Los recuentos de células no teñidas (gris) y teñidas con CD31 (verde) se normalizaron a modal. Los porcentajes se dan para el grupo teñido con CD31. (B) Análisis citométrico de flujo representativo de fibroblastos derivados del tendón de Aquiles después de un paso (P1, fila superior) y dos pasajes (P2, fila inferior). Los ejes informan de las intensidades de fluorescencia de las células no teñidas (gris) y de las células que expresan ScxGFP y teñidas con anticuerpos CD146 (colores del arco iris). (C) Análisis citométrico de flujo representativo de macrófagos derivados de la médula ósea después del cultivo. En la fila superior, los recuentos de células no teñidas (gris) y teñidas con F4/80 (verde) se normalizaron a modal. Los porcentajes se dan para el grupo teñido con F4/80. El gráfico de la fila inferior informa de las intensidades de fluorescencia de las células no teñidas (gris) y del subconjunto F4/80+ de células teñidas con anticuerpos CD206 y anticuerpos CD86 (colores del arco iris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Imágenes y apariencia del ensamblado. (A) Las fotografías representativas tomadas en el día 0 (d0) y el día 21 (d21) de cultivo (37 °C, 20%Ø2) muestran una contracción multidimensional de un hidrogel que contiene fibroblastos extrínsecos sin un explante de núcleo incrustado y una fuerte compactación radial de un hidrogel que contiene fibroblastos extrínsecos alrededor de un explante de núcleo. (B) Las fotografías representativas tomadas en el día 21 (d21) de cultivo (37 °C, 20%O2) muestran diferencias en la velocidad de compactación entre los hidrogeles libres de células, los hidrogeles libres de células fundidos alrededor de un explante de núcleo y los hidrogeles cargados de fibroblastos tendinosos moldeados alrededor de un explante de núcleo. (C) Las imágenes representativas de microscopía óptica (10x) tomadas en el día 0 (d0) y el día 21 (d21) de cultivo (37 °C, 20%Ø2) indican cambios longitudinales en la presencia de poblaciones celulares y la velocidad de compactación del hidrogel de colágeno (HG) alrededor del explante del núcleo (E) en el cocultivo de núcleos // libres de células y núcleo// fibroblastos. La representación esquemática muestra las diferencias en la compactación de hidrogel entre el núcleo // ensamblaje libre de células y el co-cultivo de núcleo // ensamble de fibroblastos. (D) Imágenes representativas de microscopía confocal tomadas en el día 7 (d7) del cocultivo de núcleos // células endoteliales, núcleo// macrófagos y núcleo// fibroblastos (37 °C, 20% Ø2). Las imágenes de la fila izquierda muestran ensamblajes con núcleos celulares teñidos en azul (DAPI) y células muertas teñidas en rosa (Ethidium homodimer-1). Las otras dos filas representan ensamblajes con núcleos celulares teñidos en azul (DAPI) y filamentos de actina en verde (F-actina). (E) Diagramas de caja que representan la viabilidad cuantificada de los ensamblajes de células centrales // endoteliales en el día 1 (d1) y el día 7 (d7) de cocultivo. N = 5. Las bisagras superior e inferior corresponden al primer y tercer cuartil (percentiles 25y 75) y la del medio a la mediana. Los bigotes se extienden desde la bisagra superior/inferior hasta el valor más grande/más pequeño no más allá de 1,5 veces el rango intercuartílico. Valores p: n.s.p > 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Estimulación mecánica de ensamblajes y medición de las propiedades mecánicas de ensamblajes. (A) Representación gráfica del dispositivo de estiramiento hecho a medida que comprende las plataformas de soporte de abrazaderas, un sensor de fuerza y un motor paso a paso. La imagen fotográfica muestra un conjunto montado en el dispositivo de estiramiento con abrazaderas. La tapa de un tubo de plástico de 15 ml (Ø: 17 mm) utilizado para la báscula. (B) Gráfico que muestra curvas representativas de tensión/deformación para explantes de núcleo (azul claro) y ensambles (rojo claro). El módulo elástico lineal (α), la tensión máxima (β) y la deformación máxima (у) se pueden extraer de los datos para caracterizar mecánicamente el explante o ensamblaje del núcleo. (C) Gráfico que muestra el módulo elástico lineal (Emod) de los ensamblajes de células endoteliales del núcleo // co-cultivados (29 °C, 3% O2) durante un curso de tiempo de 14 días después de ser sujetados (línea continua), sujetados y estirados al 2% L0 deformación (línea punteada), o sujetados y estirados al 6% L0 deformación (línea discontinua) al inicio del experimento. N = 5. Los puntos de datos se normalizaron al módulo elástico lineal inicial antes del estiramiento y todos se muestran como media (±sem). Valores p: *p < 0,05, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Cambios en el transcriptoma central después del aislamiento y cultivo en diferentes condiciones de nicho. (A) Diagrama de dispersión que representa los cambios de plegamiento en la expresión génica de Vegfa, Mmp13 y Mmp3 en explantes de núcleo murino monocultivados (37 °C, 20% O2) 2 h, 4 h, 6 h y 8 h después de aislarlos de la cola. Los cambios de plegamiento en los respectivos puntos de tiempo se normalizaron a la expresión génica 2 horas después del aislamiento. N = 2. (B) Diagramas de caja que representan los cambios de plegamiento en la expresión génica de Ca9, Vegfa, Scx y Col1a1 en explantes centrales monocultivados bajo baja tensión de oxígeno (3% O2) normalizados y comparados con los monocultivados bajo alta tensión de oxígeno (20% O2). N = 5-6. Las bisagras superior e inferior de los diagramas de caja corresponden al primer y tercer cuartil (percentiles25 y 75) y la del medio a la mediana. Los bigotes se extienden desde la bisagra superior/inferior hasta el valor más grande/más pequeño no más allá de 1,5 veces el rango intercuartílico. Los puntos de datos utilizados para la normalización se representan como puntos negros y los puntos de datos individuales como puntos rojos. Valores p: **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Análisis del secretoma específico del ensamble y del transcriptoma específico del compartimento. (A) Fotografía representativa que muestre el ensamblador en el día 7 (d7), cuando se tomaron muestras del secretoma y el transcriptoma, y representación del flujo de trabajo subyacente. (B) Concentración de VEGF (pg/mL) en el sobrenadante de los ensambles de núcleos // libres de células y núcleos // fibroblastos después de 7 días de cocultivo (37 °C, 20%O2) representados como diagramas de caja. N = 6. (C) Imágenes representativas de microscopía confocal de ensamblajes de células endoteliales después de 7 días de cocultivo (37 °C) bajo alta tensión de oxígeno (20% O2) y baja tensión de oxígeno (3% O2). Los núcleos celulares se tiñen en azul (DAPI) y las células endoteliales incrustadas coexpresan la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) junto con la subunidad b del factor de crecimiento derivado de plaquetas (Pdgfb) del marcador de células endoteliales. La línea punteada indica la interfaz compartimental entre el explante central (E) y el hidrogel cargado de células endoteliales (HG). (D) Diagrama de dispersión que representa los cambios de plegamiento en la expresión génica de Vegfa, Tnf-α, Fgf2 y Mmp3 en el compartimento central de ensamblajes de células centrales // endoteliales cocultivados bajo baja tensión de oxígeno (3% O2) normalizados y comparados con aquellos cultivados bajo alta tensión de oxígeno (20% O2). N = 2. (E) Diagrama de dispersión que representa los cambios de plegamiento en la expresión génica de Vegfa, Tnf-α, Fgf2 y Mmp3 en el compartimento extrínseco del núcleo // ensamblajes de células endoteliales con un núcleo vivo (aC) o un núcleo desvitalizado (dC) cocultivado bajo alta tensión de oxígeno (20% O2) y baja tensión de oxígeno (3% O2). Los cambios de plegamiento en las condiciones respectivas se normalizaron en el compartimento extrínseco de un núcleo // conjunto de células endoteliales con un núcleo desvitalizado (dC) co-cultivado bajo alta tensión de oxígeno (20%O2). N = 3-4. En B, las bisagras superior e inferior de los diagramas de caja corresponden al primer y tercer cuartil(percentiles 25y 75) y la intermedia a la mediana. Los bigotes se extienden desde la bisagra superior / inferior hasta el valor más grande / más pequeño no más allá de 1,5 veces el rango intercuartílico. Los valores atípicos se representan como puntos negros. Valores p: *p < 0,05. En D y E, los puntos de datos utilizados para la normalización se representan como puntos negros y los puntos de datos individuales se representan como puntos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Requisitos de entrada para los sistemas modelo de enfermedades y lesiones tendinosas. Una lista de desencadenantes de enfermedades tendinosas primarias y factores secundarios coincidentes con una selección de parámetros de entrada cuya manejabilidad es fundamental para modelar enfermedades y lesiones tendinosas. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Requisitos de salida para los sistemas modelo de enfermedades y lesiones tendinosas. Una selección de las características distintivas de la enfermedad tendinosa coincidió con una selección de parámetros de salida cuya cuantificabilidad es central para la interpretación del comportamiento del modelo de enfermedad y lesión del tendón. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Archivo suplementario 1: archivo .stl para los soportes de las abrazaderas, la estación de montaje y los moldes de la cámara. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 2: Plano del soporte de la abrazadera derecha. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 3: Plano del soporte de la abrazadera izquierda. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 4: Plano de la plataforma de montaje Haga clic aquí para descargar este archivo. Ficha complementaria 5: Plano de abrazaderas metálicas. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 6: Imagen que muestra la contracción del hidrogel libre de células. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo Suplementario 7: Imagen que muestra un explante de núcleo desvitalizado. Haga clic aquí para descargar este archivo.