Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle
Summary
Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH – H 2O2 – Antigène Retrieval – 2,2′-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.
Abstract
Malgré les nombreuses techniques de nettoyage qui ont émergé au cours de la dernière décennie, le traitement des cerveaux humains post-mortem reste une tâche difficile en raison de ses dimensions et de sa complexité, qui rendent l’imagerie à résolution micrométrique particulièrement difficile. Cet article présente un protocole permettant d’effectuer la reconstruction de portions volumétriques du cerveau humain en traitant simultanément des dizaines de coupes avec le protocole de transformation tissulaire SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiéthanol [TDE]), qui permet l’élimination, le marquage et l’imagerie séquentielle des échantillons par microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM). SHORT permet un nettoyage rapide des tissus et un multi-marquage homogène de tranches épaisses avec plusieurs marqueurs neuronaux, permettant l’identification de différentes sous-populations neuronales dans la matière blanche et grise. Après le déblaiement, les tranches sont imagées via LSFM avec une résolution micrométrique et dans plusieurs canaux simultanément pour une reconstruction 3D rapide. En combinant l’analyse SHORT et LSFM dans le cadre d’un protocole de routine à haut débit, il est possible d’obtenir la reconstruction 3D de la cytoarchitecture de grandes surfaces volumétriques à haute résolution en peu de temps, permettant ainsi une caractérisation structurelle complète du cerveau humain.
Introduction
L’analyse de l’organisation moléculaire 3D et de la cytoarchitecture de grands volumes du cerveau humain nécessite une transparence optique des échantillons, obtenue grâce à des protocoles avec un temps de traitement important. Des techniques de clarification optique ont été développées pour minimiser l’hétérogénéité de l’indice de réfraction (IR) dans les tissus, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et augmentant la profondeur de pénétration de la lumière pour l’imagerie haute résolution 1,2,3,4,5. Les progrès actuels dans les méthodes de nettoyage et de marquage des tissus profonds permettent l’imagerie volumétrique d’organes et d’embryons de rongeurs intacts en exploitant des techniques de microscopiede pointe 6,7,8,9,10,11,12.
Cependant, la reconstruction volumétrique 3D de grandes zones du cerveau humain post-mortem représente encore une tâche difficile par rapport aux organismes modèles. La composition biologique complexe et les conditions variables de fixation et de stockage post-mortem peuvent compromettre l’efficacité de l’élimination des tissus, la profondeur de pénétration des anticorps et la reconnaissance des épitopes 13,14,15,16,17,18,19. De plus, la section mécanique des tissus, ainsi que le nettoyage et l’étiquetage ultérieurs de chaque tranche, sont toujours nécessaires pour obtenir un nettoyage efficace et un marquage uniforme de grandes zones du cerveau humain, ce qui entraîne de longs temps de traitement et la nécessité d’un équipement personnalisé sophistiqué, par rapport aux organismes modèles 15,20,21,22.
La technique de transformation tissulaire S WITCH – H2O2 – antigène Retrieval –TDE (SHORT) a été développée spécifiquement pour analyser de grands volumes du cerveau humain18,23. Cette méthode utilise la préservation structurelle tissulaire du protocole SWITCH11 et des concentrations élevées de peroxyde d’hydrogène pour diminuer l’autofluorescence tissulaire, en combinaison avec la restauration d’épitopes. SHORT permet une coloration uniforme des tranches de cerveau humain avec des marqueurs pour différents sous-types neuronaux, cellules gliales, vascularisation et fibres myélinisées18,24. Ses résultats sont compatibles avec l’analyse des protéines de basse et de haute densité. Les niveaux élevés de transparence et l’uniformité du marquage qui en résultent permettent la reconstruction volumétrique de tranches épaisses par microscopie à fluorescence, en particulier pour l’acquisition rapide d’appareils à nappe de lumière pouvant être utilisés 18,24,25,26,27.
Dans ce travail, nous décrivons comment la technique de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le nettoyage simultané et le marquage multi-tours de dizaines de sections de cerveau humain fixées au formol. Quatre marqueurs fluorescents différents peuvent être utilisés ensemble, ce qui permet d’identifier différentes sous-populations cellulaires. Après le nettoyage, l’imagerie volumétrique à haute résolution peut être réalisée par microscopie à fluorescence. Ici, nous avons utilisé un LSFM inversé 18,24,25,26,27 sur mesure, qui permet une coupe optique rapide de l’échantillon et une acquisition rapide de plusieurs canaux en parallèle. Avec ce protocole à haut débit de routine, il est possible d’obtenir une caractérisation cellulaire et structurale complète avec une résolution subcellulaire de grandes zones du cerveau humain, comme cela a déjà été démontré dans la cartographie de l’ensemble de l’aire de Broca23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie à haute résolution et la reconstruction 3D de grandes zones du cerveau humain nécessitent une coupe mécanique des tissus, suivie d’un nettoyage optique et d’un immunomarquage de tranches individuelles. Le protocole présenté ici décrit comment la méthode de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain pour la reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire avec LSFM.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Bruce Fischl, du Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, d’avoir fourni les échantillons de cerveau humain analysés dans le cadre de cette étude. Ce projet a reçu un financement du programme-cadre de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 654148 (Laserlab-Europe), du programme-cadre Horizon 2020 de l’Union européenne pour la recherche et l’innovation dans le cadre de l’accord de subvention spécifique n° 785907 (Human Brain Project SGA2) et n° 945539 (Human Brain Project SGA3), du General Hospital Corporation Center des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution U01 MH117023, et du ministère italien de l’Éducation dans le cadre de l’Euro-Bioimaging Italian Node (infrastructure de recherche ESFRI). Enfin, cette recherche a été réalisée avec la contribution de la « Fondazione CR Firenze ». Le contenu de ce travail relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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