Limpeza óptica e marcação para microscopia de fluorescência de folha de luz em imagens cerebrais humanas em larga escala
Summary
O presente protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para limpeza óptica rápida e simultânea, marcação multi-redonda e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem, combinando a técnica de transformação de tecido curto (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) com imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz em um protocolo de alto rendimento de rotina.
Abstract
Apesar das inúmeras técnicas de clareamento que surgiram na última década, o processamento de cérebros humanos post-mortem continua sendo uma tarefa desafiadora devido às suas dimensões e complexidade, que tornam as imagens com resolução micrométrica particularmente difíceis. Este trabalho apresenta um protocolo para realizar a reconstrução de porções volumétricas do cérebro humano por meio do processamento simultâneo de dezenas de cortes com o protocolo de transformação tecidual SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]), que permite a limpeza, marcação e obtenção de imagens sequenciais das amostras com microscopia de fluorescência em folha de luz (LSFM). O SHORT proporciona rápida limpeza tecidual e multimarcação homogênea de cortes espessos com vários marcadores neuronais, permitindo a identificação de diferentes subpopulações neuronais tanto na substância branca quanto na cinzenta. Após a limpeza, as fatias são fotografadas via LSFM com resolução micrométrica e em múltiplos canais simultaneamente para uma rápida reconstrução 3D. Combinando SHORT com LSFM dentro de um protocolo de alto rendimento de rotina, é possível obter a reconstrução da citoarquitetura 3D de grandes áreas volumétricas em alta resolução em um curto espaço de tempo, permitindo assim uma caracterização estrutural abrangente do cérebro humano.
Introduction
Analisar a organização molecular 3D e a citoarquitetura de grandes volumes do cérebro humano requer transparência óptica dos espécimes, conseguida através de protocolos com extenso tempo de processamento. Técnicas de clareamento óptico foram desenvolvidas para minimizar a heterogeneidade do índice de refração (IR) dentro dos tecidos, reduzindo o espalhamento de luz e aumentando a profundidade de penetração da luz para imagens de alta resolução 1,2,3,4,5. Os avanços atuais nos métodos de clareamento e marcação tecidual profunda permitem a obtenção volumétrica de órgãos e embriões de roedores intactos, utilizando técnicas de microscopia de ponta6,7,8,9,10,11,12.
No entanto, a reconstrução volumétrica 3D de grandes áreas do cérebro humano post-mortem ainda representa uma tarefa desafiadora em comparação com organismos modelo. A complexa composição biológica e as variáveis condições de fixação e armazenamento post-mortem podem comprometer a eficiência do clareamento tecidual, a profundidade de penetração de anticorpos e o reconhecimento de epítopos13,14,15,16,17,18,19. Além disso, a secção mecânica dos tecidos e a subsequente limpeza e marcação de cada corte ainda são necessárias para obter uma limpeza eficiente e marcação uniforme de grandes áreas cerebrais humanas, resultando em longos tempos de processamento e na necessidade de sofisticados equipamentos personalizados, em comparação com organismos modelo 15,20,21,22.
A técnica de transformação tecidual SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) foi desenvolvida especificamente para analisar grandes volumes do cérebro humano18,23. Este método emprega a preservação estrutural tecidual do protocolo SWITCH11 e altas concentrações de hidrogênio peróxido para diminuir a autofluorescência tecidual, em combinação com a restauração de epítopos. O SHORT permite coloração uniforme de cortes cerebrais humanos com marcadores para diferentes subtipos neuronais, células gliais, vasculatura e fibras mielinizadas18,24. Seus resultados são compatíveis com a análise de proteínas de baixa e alta densidade. Os altos níveis de transparência resultantes e a marcação uniforme permitem a reconstrução volumétrica de cortes espessos com microscopia de fluorescência, em particular, para que equipamentos fotográficos de aquisição rápida possam ser utilizados 18,24,25,26,27.
Neste trabalho, descrevemos como a técnica de transformação de tecido SHORT pode ser usada para limpeza simultânea e marcação multi-redonda de dezenas de cortes cerebrais humanos fixados em formal. Quatro marcadores fluorescentes diferentes podem ser usados em conjunto, levando à identificação de diferentes subpopulações celulares. Após a limpeza, imagens volumétricas de alta resolução podem ser realizadas com microscopia de fluorescência. Neste trabalho, utilizou-se um LSFM invertido sob medida18,24,25,26,27, que permite rápida seccionagem óptica da amostra e rápida aquisição de múltiplos canais em paralelo. Com este protocolo de alto rendimento rotineiro, é possível obter uma caracterização celular e estrutural abrangente com resolução subcelular de grandes áreas do cérebro humano, como já demonstrado no mapeamento de toda uma área deBroca23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imagens de alta resolução e reconstrução 3D de grandes áreas cerebrais humanas requerem secção mecânica do tecido seguida de clareamento óptico e imunomarcação de cortes únicos. O protocolo aqui apresentado descreve como o método de transformação tecidual SHORT pode ser usado para processamento rápido e simultâneo de múltiplas seções espessas do cérebro humano para reconstrução cerebral 3D com resolução subcelular com LSFM.
Ao contrário de outras abordagens, com o mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, por fornecer as amostras de cérebro humano analisadas neste estudo. Este projeto recebeu financiamento do Programa-Quadro de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 654148 (Laserlab-Europe), do Programa-Quadro de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção Específico n.º 785907 (Projeto Cérebro Humano SGA2) e n.º 945539 (Projeto Cérebro Humano SGA3), do Centro da Corporação Hospitalar Geral dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prémio U01 MH117023, e do Ministério da Educação italiano no âmbito do Nó Italiano Euro-Bioimaging (infraestrutura de investigação ESFRI). Finalmente, esta pesquisa foi realizada com a contribuição da “Fondazione CR Firenze”. O conteúdo deste trabalho é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa, necessariamente, a opinião oficial do National Institutes of Health. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
