Monitoring van fijn en associatief motorisch leren bij muizen met behulp van de Erasmusladder
Summary
Dit artikel presenteert een protocol dat een niet-invasieve en geautomatiseerde beoordeling van fijne motorische prestaties mogelijk maakt, evenals adaptief en associatief motorisch leren bij uitdagingen, met behulp van een apparaat genaamd de Erasmusladder. De moeilijkheidsgraad van de taak kan worden getitreerd om motorische stoornissen te detecteren, variërend van grote tot subtiele gradaties.
Abstract
Gedrag wordt gevormd door acties, en acties vereisen motorische vaardigheden zoals kracht, coördinatie en leren. Geen van de gedragingen die essentieel zijn voor het in stand houden van het leven zou mogelijk zijn zonder het vermogen om van de ene positie naar de andere over te gaan. Helaas kunnen motorische vaardigheden worden aangetast bij een breed scala aan ziekten. Daarom is het onderzoeken van de mechanismen van motorische functies op cellulair, moleculair en circuitniveau, evenals het begrijpen van de symptomen, oorzaken en progressie van motorische stoornissen, cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen. Hiervoor worden vaak muismodellen gebruikt.
Dit artikel beschrijft een protocol dat het mogelijk maakt om verschillende aspecten van motorische prestaties en leren bij muizen te monitoren met behulp van een geautomatiseerd hulpmiddel genaamd de Erasmusladder. De test omvat twee fasen: een eerste fase waarin muizen worden getraind om te navigeren op een horizontale ladder die is opgebouwd uit onregelmatige sporten (“fijne motoriek”), en een tweede fase waarin een obstakel wordt gepresenteerd op het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn (‘uitgedaagd motorisch leren’) of worden voorafgegaan door een auditieve toon (‘associatief motorisch leren’). De taak is eenvoudig uit te voeren en wordt volledig ondersteund door geautomatiseerde software.
Dit rapport laat zien hoe verschillende uitlezingen van de test, wanneer geanalyseerd met gevoelige statistische methoden, een nauwkeurige monitoring van de motoriek van muizen mogelijk maken met behulp van een klein cohort muizen. We stellen voor dat de methode zeer gevoelig zal zijn voor het evalueren van motorische aanpassingen die worden aangedreven door veranderingen in de omgeving, evenals subtiele motorische tekorten in een vroeg stadium bij gemuteerde muizen met gecompromitteerde motorische functies.
Introduction
Er zijn verschillende tests ontwikkeld om motorische fenotypes bij muizen te beoordelen. Elke test geeft informatie over een specifiek aspect van motorisch gedrag1. De open veldtest informeert bijvoorbeeld over de algemene motoriek en angsttoestand; de rotarod- en loopbalktests op coördinatie en evenwicht; Voetafdrukanalyse gaat over lopen; de loopband of het loopwiel bij gedwongen of vrijwillige lichaamsbeweging; En het complexe wiel gaat over het leren van motorische vaardigheden. Om motorische fenotypes van muizen te analyseren, moeten onderzoekers deze tests opeenvolgend uitvoeren, wat veel tijd en moeite kost en vaak meerdere diercohorten. Als er informatie is op cellulair of circuitniveau, kiest de onderzoeker normaal gesproken voor een test die een gerelateerd aspect bewaakt en van daaruit volgt. Het ontbreekt echter aan paradigma’s die verschillende aspecten van motorisch gedrag op een geautomatiseerde manier onderscheiden.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van de Erasmus Ladder 2,3, een systeem dat een uitgebreide beoordeling van een verscheidenheid aan motorische leerkenmerken bij muizen mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen zijn de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de methode, samen met het vermogen om motorische moeilijkheden te titreren en om tekorten in motorische prestaties te scheiden van verminderd associatief motorisch leren. Het hoofdonderdeel bestaat uit een horizontale ladder met afwisselend hoge (H) en lage (L) sporten uitgerust met aanraakgevoelige sensoren die de positie van de muis op de ladder detecteren. De ladder is gemaakt van 2 x 37 sporten (L, 6 mm; H, 12 mm) op een onderlinge afstand van 15 mm en in een afwisselend patroon van links naar rechts met tussenruimten van 30 mm (figuur 1A). Sporten kunnen afzonderlijk worden verplaatst om verschillende moeilijkheidsgraden te genereren, dat wil zeggen een obstakel creëren (de hoge sporten met 18 mm verhogen). In combinatie met een geautomatiseerd registratiesysteem en het associëren van modificaties van het sportpatroon met sensorische stimuli, test de Erasmus-ladder voor fijn motorisch leren en aanpassing van motorische prestaties als reactie op omgevingsuitdagingen (verschijnen van een hogere sport om een obstakel te simuleren, een ongeconditioneerde stimulus [VS]) of associatie met sensorische stimuli (een toon, een geconditioneerde stimulus [CS]). Het testen omvat twee verschillende fasen, die elk de verbetering van de motorische prestaties gedurende 4 dagen beoordelen, waarin muizen een sessie van 42 opeenvolgende proeven per dag ondergaan. In de beginfase worden muizen getraind om door de ladder te navigeren om “fijn” of “bekwaam” motorisch leren te beoordelen. De tweede fase bestaat uit interleaved proeven waarbij een obstakel in de vorm van een hogere sport wordt gepresenteerd in het pad van het bewegende dier. De verstoring kan onverwacht zijn om “uitgedaagd” motorisch leren te beoordelen (alleen in de VS onderzocht) of aangekondigd door een auditieve toon om “associatief” motorisch leren te beoordelen (gepaarde onderzoeken).
De Erasmusladder is relatief recent ontwikkeld 2,3. Het is niet op grote schaal gebruikt omdat het opzetten en optimaliseren van het protocol gerichte inspanning vergde en specifiek was ontworpen om cerebellair-afhankelijk associatief leren te beoordelen zonder in detail het potentieel ervan te onderzoeken om andere motorische stoornissen aan het licht te brengen. Tot op heden is het gevalideerd voor zijn vermogen om subtiele motorische stoornissen te onthullen die verband houden met cerebellaire disfunctie bij muizen 3,4,5,6,7,8. Bijvoorbeeld, connexine36 (Cx36) knock-out muizen, waar gap junctions zijn aangetast in olivaire neuronen, vertonen vuurtekorten als gevolg van een gebrek aan elektrotonische koppeling, maar het motorfenotype was moeilijk te lokaliseren. Testen met behulp van de Erasmus-ladder suggereerden dat de rol van inferieure olivaire neuronen in een cerebellaire motorische leertaak is om nauwkeurige temporele codering van stimuli te coderen en leerafhankelijke reacties op onverwachte gebeurtenissen te vergemakkelijken 3,4. Fragile X Messenger Ribonucleoproteïne 1 (Fmr1) knock-out muis, een model voor Fragile-X-Syndrome (FXS), vertoont een bekende cognitieve stoornis samen met mildere defecten in procedurele geheugenvorming. Fmr1-knock-outs vertoonden geen significante verschillen in staptijden, misstappen per proef of verbetering van de motorische prestaties tijdens sessies in de Erasmus-ladder, maar slaagden er niet in hun looppatroon aan te passen aan het plotseling verschijnende obstakel in vergelijking met hun wild-type (WT) nestgenoten, wat specifieke procedurele en associatieve geheugentekorten bevestigt 3,5. Bovendien vertoonden celspecifieke mutante muizenlijnen met defecten in de cerebellaire functie, waaronder verminderde output van Purkinje-cellen, potentiëring en interneuron- of korrelceloutput van de moleculaire laag, problemen in de motorische coördinatie met veranderde verwerving van efficiënte stappatronen en in het aantal stappen dat werd gezet om de ladder over te steken6. Neonataal hersenletsel veroorzaakt cerebellaire leerachterstanden en Purkinje-celdisfunctie die ook met de Erasmusladder 7,8 konden worden opgespoord.
In deze video presenteren we een uitgebreide stap-voor-stap handleiding, waarin de inrichting van de gedragskamer, het gedragstestprotocol en de daaropvolgende gegevensanalyse worden beschreven. Dit rapport is opgesteld om toegankelijk en gebruiksvriendelijk te zijn en is speciaal ontworpen om nieuwkomers te helpen. Dit protocol geeft inzicht in verschillende fases van motorische training en verwachte motorische patronen die muizen aannemen. Ten slotte stelt het artikel een systematische workflow voor data-analyse voor met behulp van een krachtige niet-lineaire regressiebenadering, compleet met waardevolle aanbevelingen en suggesties voor het aanpassen en toepassen van het protocol in andere onderzoekscontexten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Erasmusladder biedt grote voordelen voor de beoordeling van motorische fenotypes die verder gaan dan de huidige benaderingen. Testen is eenvoudig uit te voeren, geautomatiseerd, reproduceerbaar en stelt onderzoekers in staat om verschillende aspecten van motorisch gedrag afzonderlijk te beoordelen met behulp van een enkel muiscohort. In de huidige studie maakte reproduceerbaarheid het mogelijk om robuuste gegevens te genereren met een klein aantal WT-muizen die gebruik maakten van de kenmerken van het apparaat, het ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de audiovisuele technicus en videoproducent Rebeca De las Heras Ponce en de hoofddierenarts Gonzalo Moreno del Val, voor het toezicht op goede praktijken tijdens muizenexperimenten. Het werk werd gefinancierd door subsidies van het GVA Excellence Program (2022/8) en het Spaanse Onderzoeksbureau (PID2022143237OB-I00) aan Isabel Pérez-Otaño.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- . Available from: https://www.noldus.com/erasmusladder (2023)
- Cupido, A., et al. . Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
